Las enfermedades reumáticas representan el tipo más común de los trastornos inflamatorios. En general, hasta un 2% de la población padece alguna enfermedad reumática mediada inmunológicamente entre las que encontramos la artritis reumatoide. Algunos estudios genéticos sugieren que aproximadamente el 50% de los agentes causantes proceden del genoma, lo que explicaría el fuerte componente ambiental en el desarrollo y progresión de esta patología.
Con objeto de profundizar sobre las técnicas de análisis molecular aplicables a la artritis reumatoide, se ha realizado una búsqueda bibliográfica acotada a los últimos diez años, de la cual se obtuvieron un total de 41 trabajos de los cuales 27 han sido utilizados para la redacción del texto.
Diagnóstico Molecular en la Artritis Reumatoide. Aplicación del Microarray.
Tomás Pérez Fernández. Diplomado en Fisioterapia. Licenciado en Humanidades. Prof. Colaborador del Departamento de Fisioterapia. Facultad de Medicina. Universidad CEU-San Pablo.
Arturo Pérez Gosálvez. Diplomado en Fisioterapia. Master en Estudio y Tratamiento del Dolor. Prof. Colaborador del Departamento de Fisioterapia. Facultad de Medicina. Universidad CEU-San Pablo.
Beatriz Cano Díez. Diplomada en Fisioterapia. Diplomada en Magisterio. Prof. Colaboradora del Departamento de Fisioterapia. Facultad de Medicina. Universidad CEU-San Pablo.
Resumen.
Las enfermedades reumáticas representan el tipo más común de los trastornos inflamatorios. En general, hasta un 2% de la población padece alguna enfermedad reumática mediada inmunológicamente entre las que encontramos la artritis reumatoide.
Algunos estudios genéticos sugieren que aproximadamente el 50% de los agentes causantes proceden del genoma, lo que explicaría el fuerte componente ambiental en el desarrollo y progresión de esta patología.
Con objeto de profundizar sobre las técnicas de análisis molecular aplicables a la artritis reumatoide, se ha realizado una búsqueda bibliográfica acotada a los últimos diez años, de la cual se obtuvieron un total de 41 trabajos de los cuales 27 han sido utilizados para la redacción del texto.
El diagnóstico de las enfermedades reumáticas no se presenta sencillo, ya que partiendo del desconocimiento de la fisiopatología, alcanzar un diagnóstico certero e identificar las dianas terapéuticas parece harto difícil. Por ello, el screening de la expresión de distintos genes abre la puerta a mejorar la comprensión de los mecanismos patológicos de las enfermedades reumáticas. Los microarrays suponen una esperanza de cara al diagnóstico gracias a su poder para caracterizar la enfermedad, no por la aparición de un gen concreto, sino por la expresión de multitud de genes.
Debido a la importante prevalencia de estas afecciones, es probable que el potencial de su análisis genómico y proteómico pueda aportar beneficios, especialmente para comprender el fenómeno inflamatorio y el modelo autoinmune que participa en ellas.
Abstract.
Rheumatic diseases are the most common type of inflammatory disorders. Generally, up to 2% of the population have some immune-mediated rheumatic disease among which we find rheumatoid arthritis.
Some genetic studies suggest that approximately 50% of the agents responsible are from the genome, which may explain the strong environmental component existing in the development and progression of this disease.
So as to go in depth into the molecular analysis techniques applicable on rheumatoid arthritis, we have conducted a literature search bounded to the last ten years, from which we obtained a total of 41 papers, 21 of which have been used to drafting text.
The diagnosis of rheumatic diseases is not easy, starting from the fact that the pathophysiology is not clear, it seems very difficult to achieve an accurate diagnosis and identify therapeutic targets. Therefore, the screening of the expression of different genes opens the door to a better understanding of the pathogenic mechanisms of rheumatic diseases. Microarrays represent a hope for the diagnosis thanks to its power to characterize the disease, not by the appearance of a specific gene but the expression of many genes.
Due to the significant prevalence of these conditions, it is likely that the potential of genomic and proteomic analysis can provide benefits, especially for understanding the inflammatory phenomenon and autoimmune model which participate in them.
Palabras clave: Diagnóstico molecular, Artritis reumatoide, Enfermedad autoinmune, Microarray.
Key words: Molecular Diagnostic Techniques, Rheumatoid Arthritis, Autoinmune disease, Microarray.
Introducción.
Las enfermedades reumáticas representan el tipo más común de los trastornos inflamatorios. En general, hasta un 2% de la población padece alguna enfermedad reumática mediada inmunológicamente entre las que encontramos la artritis reumatoide (AR), las espondiloartropatías (SpA) y las enfermedades autoinmunes sistémicas 1.
La artritis reumatoide en su fase aguda, está dominada por los fenómenos inflamatorios, dando lugar a dolor, pérdida de la función y un grave deterioro en la calidad de vida. Además de estas consecuencias perjudiciales para el paciente, esta enfermedad conlleva un llamativo impacto socio-económico que contribuye a aumentar los costos directos e indirectos. El desarrollo demográfico indica claramente que las enfermedades reumáticas aumentarán drásticamente durante las próximas décadas y serán iguales en importancia a las patologías cardiovasculares y el cáncer 1.
A pesar de la importancia clínica de estas enfermedades, poco se sabe sobre su etiopatogenia, aparte del reconocimiento de que estas enfermedades reumáticas de carácter inflamatorio se producen por una mediación autoinmune. Por ejemplo, en la espondiloartropatía se sabe que comienza a partir de la invasión articular de un agente infeccioso capaz de perturbar el sistema inmunológico 2,3.
En la artritis reumatoide, presumiblemente podría tratarse también de algún agente infeccioso capaz de activar la cascada inflamatoria aunque estos agentes no han sido identificados. Dada la distribución universal de la enfermedad, se ha pensado en ciertos patógenos ubicuos como el micoplasma, el citomegalovirus, el virus de Epstein Barr, el parvovirus y el virus de la rubeola 3,4.
Sin embargo, dos estudios y otro tipo de análisis genéticos sugieren que aproximadamente el 50% de los agentes causantes proceden del genoma, lo que explicaría el fuerte componente ambiental en el desarrollo y progresión de esta patología 5.
Pero si existe un rasgo común a todas las enfermedades reumáticas, es la mediación por mecanismos celulares (células T y macrófagos) del sistema inmunológico, produciendo los auto-anticuerpos y los complejos inmunes responsables del cuadro clínico6. Esta respuesta humoral define el comienzo y la progresión de las enfermedades autoinmunes, determinado por tres fases 2:
Debido a la importante prevalencia de estas afecciones, es probable que el potencial de su análisis genómico y proteómico pueda aportar beneficios, especialmente para comprender el fenómeno inflamatorio y el modelo autoinmune que participa en ellas. Por otro lado, el análisis de las enfermedades reumáticas desde este punto de vista ofrece una variedad de ventajas5:
Son enfermedades frecuentes: lo que proporciona grandes cohortes de sujetos y potencia el análisis epidemiológico. Además, los éxitos en la terapéutica actual conseguidos en las fases de crisis, permiten poder realizar un estudio a largo plazo de las cohortes al mejorar su esperanza de vida.
Las muestras de tejido son fácilmente accesibles: al contrario que en otros casos, pueden ser tomadas con facilidad cantidades suficientes de células vivas (p.ej. sinoviales) distintas a las células sanguíneas, tan utilizadas en éste tipo de análisis. Desgraciadamente las limitaciones éticas y anatómicas en otras enfermedades dificultan el acceso a los tejidos diana.
Estas enfermedades pueden servir de modelos frente al estudio de otras también mediadas por mecanismos inflamatorios y autoinmunes.
Material y métodos.
Para la realización del presente trabajo, se ha realizado una búsqueda bibliográfica a través del motor de búsqueda EBSCO en las bases de datos Medline, CINAHL, Mediclatina y Biomedical Reference Collection. También se han consultado las bases de datos de Genetests, OMIM, y Science Direct. Se utilizaron de manera combinada los siguientes términos Mesh: Molecular Diagnostic Techniques, Arthritis, Rheumatoid y Cytogenetic Analysis. Con objeto de enriquecer las definiciones y caracterización clínica de los procesos patológicos mencionados, se han consultado igualmente fuentes primarias sobre la materia.
La búsqueda fue acotada al periodo 1999-2009, seleccionando trabajos en texto completo de revisión bibliográfica sobre el tema en cuestión, así como estudios experimentales in vitro o in vivo realizados en humanos y/o modelos animales, publicados en lengua inglesa o española. Se obtuvieron un total de 41 trabajos de los cuales 27 han sido utilizados para la redacción del texto.
Resultados.
La Artritis Reumatoide.
Esta enfermedad se caracteriza por la presencia de una sinovitis inflamatoria inmunomediada con capacidad para invadir y destruir las matrices extracelulares del cartílago articular y el hueso, hecho que la distingue de las artritis no destructivas. En cuanto a la patomecánica, los motivos que impulsan la inflamación pueden ser comparables a otras artritis, pero difiere en los factores que producen la destrucción articular 3.
Como cualquier enfermedad autoinmune, la AR se caracteriza por la infiltración en el tejido sinovial de células inflamatorias, sobre todo las células T, macrófagos, células plasmáticas y células dendríticas. Estas células, suelen activarse ante la presencia de antígenos y en las enfermedades reumáticas estos son producidos o son sustancias normales del propio cuerpo. En este caso, los auto-antígenos que llevan a la activación crónica de las células T y los macrófagos se desconocen 3,6.
Debido a la persistencia de los fenómenos inflamatorios, se acumulan en la sinovial gran cantidad de citoquinas y otros factores de crecimiento. Entre otras sustancias, se hallan mediadores de la mediación vascular, (IL-1, TNF-a, IFN-g), factores quimiotácticos (TGF-h, IL-8) y angiogénicos (IL-8, FGFs, factor de crecimiento endotelial vascular). Por supuesto, la mayoría de estos factores no son exclusivos de la AR, y se pueden observar también aunque en menor grado en las sinoviales de pacientes que padecen artrosis degenerativa 7,8.
Por otro lado, la AR posee también características de una enfermedad influida genéticamente, ya que la expresión de los epítopos de los antígenos leucocitarios humanos (HLA) clase II compartida (HLA-DR4 y RP1) parece aumentar la susceptibilidad a padecer la enfermedad. El complejo proceso inflamatorio resultante está asociado con un crecimiento hiperplásico de los sinoviocitos, tanto los de tipo A (fagocítico) como los de tipo B (fibroblásticos). Este crecimiento celular y la angiogénesis secundaria a el, son los generadores del engrosamiento capsular por el llamado pannus, que contribuye a la destrucción articular. Estas células hiperplásicas sinoviales, muestran el mismo comportamiento de crecimiento desordenado y acelerado incluso en condiciones in vitro, que recuerda al de las células neoplásicas. Curiosamente, y aunque la AR no tiene que ver con la neoplasia sinovial, muchos de los factores conocidos que promueven la angiogénesis y la proliferación de los tumores invasivos están presentes y son producidos por éstas células sinoviales in vivo e in vitro 7.
Aportaciones de la tecnología Microarray a la Artritis Reumatoide.-
Como hemos visto, el diagnóstico de las enfermedades reumáticas no se presenta sencillo, ya que partiendo del desconocimiento de la fisiopatología, alcanzar un diagnóstico certero e identificar las dianas terapéuticas parece harto difícil. Por ello, el screening de la expresión de distintos genes abre la puerta a mejorar la comprensión de los mecanismos patológicos de enfermedades reumáticas como la artritis reumatoide.
En un principio, los perfiles serológicos de auto-reactividad proporcionan importantes parámetros para identificar y clasificar la enfermedad. Partiendo de la existencia de una predisposición familiar, ésta se ha convertido en uno de los objetivos principales de los análisis genómicos, de ahí que en la AR no solo se puedan utilizar análisis multiparámetro mediante arrays de ARNm, sino también de proteínas y para la localización de polimorfismos genéticos (SNP´s)5.
Por el momento, para realizar el diagnóstico y clasificación de las enfermedades reumáticas, la herramienta más habitual se basa en análisis fenotípicos y signos clínicos. Dentro de los escasos parámetros moleculares establecidos, son utilizados actualmente en la caracterización diagnóstica de la artritis reumatoide 5,9:
Aparte de estos, se han investigado muchos parámetros moleculares incluyendo las citoquinas, moléculas de señalización intracelular y factores de transcripción, marcadores de la destrucción de la matriz y marcadores genéticos como los de los locus del HLA. Por el momento, la falta de especificidad de la enfermedad así como la variabilidad de presentación entre los pacientes, han desalentado su uso para fines de diagnóstico de rutina 9.
Las modernas técnicas de la genómica también han sido utilizadas para conseguir las nuevas estrategias diagnósticas como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) y la interleucina-1 (IL-1) 10.
Dada la heterogeneicidad en la presentación de la artritis reumatoide (como ocurre en la mayoría de las enfermedades reumáticas), los microarrays (biochip de ADN que permite la hibridación simultánea de cientos de genes, posibilitando la monitorización de la expresión génica) suponen una esperanza de cara al diagnóstico gracias a su poder para caracterizar la enfermedad por la aparición de un gen concreto, sino por la expresión de multitud de genes. De esta forma no solo nos permitirán detectar una enfermedad reumática concreta, sino caracterizarla en supuestos sub-tipos que actualmente no se reconocen y que podrían explicar la variabilidad de presentación 5,11,12.
Para la realización de los microarrays en un paciente con artritis reumatoide, las muestras de su material genético se puede extraer de 2 fuentes: Tejido sinovial o purificado de tipos celulares. La primera de las muestras es más específica, pues se toma directamente del tejido afectado, pero tiene el inconveniente de la dificultad para discernir la procedencia del material genético analizado dada la gran infiltración celular de este tejido en la artritis reumatoide. Por otro lado, el análisis de tipos celulares purificados es más preciso en cuanto a detectar el tipo específico de célula patológica y su perfil y regulación de genes concretos, aunque está sujeto a artefactos del proceso de purificación. Ambas muestras proporcionan complementariamente los datos necesarios, y gracias al apoyo de la bioinformática, se pueden compensar y eliminar los problemas de la caracterización génica, depurando y optimizando los datos obtenidos 12,13.
Microarray en tejido sinovial.
Heller et al. demostraron la aplicabilidad de los arrays sobre muestra de tejido sinovial con un chip de 96 genes pre-seleccionados para la detección de genes implicados en la destrucción conjunta (metaloproteinasa estromelisina 1, colagenasa 1, gelatinasa A y Metalo-elastasa humana e inhibidores titulares de metaloproteinasa 1 y 3) y factores implicados en los procesos inflamatorios (IL-6, VCAM, MCP-1 y RANTES) 14.
Van Der Pouw et al. 15, realizaron análisis más detallados de los tejidos sinoviales utilizando un microchip con 24.000 muestras de cDNA. Mediante su estudio sugieren una sub-clasificación en al menos dos diferentes grupos de AR definidos molecularmente: uno con marcas de alta inflamación por activación de células T y B (inmunoglobulinas, LCK, STAT1, SDF1, HLA de clase II, IFI30, etc) y el otro con baja inflamación pero con signos de actividad en procesos de remodelación tisular, incluyendo la expresión de diferentes tipos de colágeno (II, XI) y la activación de vías de señalización ya conocidas en la morfogénesis embrionaria (Wnt5a). Otros estudios confirman estos resultados 16,17,18,19.
Microarray a través de células sanguíneas.
Como ya hemos comentado, otra de las opciones disponibles para la obtención de material genético es la extracción y cultivo de células de muestras de sangre periférica. La sangre periférica contiene distintas variedades de leucocitos que podemos utilizar para determinar procesos inflamatorios sistémicos.
Maas et al. investigaron las células mononucleares de sangre periférica de los pacientes con artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes tipo I y la esclerosis múltiple, con objeto de encontrar elementos comunes y divergentes en sus perfiles de expresión génica. Compararon los perfiles de expresión de las enfermedades citadas con perfiles de donantes sanos a los que se les vacunó contra la gripe para provocar la respuesta normal del sistema inmunológico. Finalmente, no se encontraron patrones que permitieran distinguir entre las diferentes enfermedades autoinmunes, pero se pudieron identificar los genes candidatos de la autoinmunidad involucrados en la apoptosis celular, diferenciación y migración celular, aunque estos hallazgos no tenían relación con los genes inmuno-relacionados20.
Otro estudio de Gu et al. también se realizó con células mononucleares de sangre periférica sometidas a un test de expresión de 588 genes en pacientes con espondiloartropatía y artritis reumatoide. En este trabajo también se identificaron genes candidatos como los del antígeno mieloide nuclear de diferenciación, dos miembros de la familia proteica S100 (calgranulina A y B), y otros factores relacionados con receptores quimiotácticos y del TNF 21.
Polimorfismo de nucleótidos individuales y Artritis Reumatoide.
Actualmente, la tecnología genómica basada en el microarray se está aplicando a la detección y cribado de polimorfismos genéticos de manera rápida y eficaz. Existen evidencias de la asociación de ciertas enfermedades reumáticas con polimorfismos de los HLA 22.
Las hipótesis de los estudios actuales se basan en localizar los posibles polimorfismos marcadores de enfermedades reumáticas. Así, se han propuesto polimorfismos en secuencias reguladoras o codificadoras de los genes PADI4, SLC22A4 y PD-1 para la artritis reumatoide 23.
Parece por lo tanto descartada la explicación para las enfermedades reumáticas y más en concreto para la AR, que pudieran deberse a un rasgo monogénico o ser poligénicas, teniendo pendiente además la hipótesis del agente patógeno externo desencadenante. Por esto, el análisis multifactorial y la importancia dentro de éste de los microarrays y la bioinformática, pueden contribuir a la identificación de marcadores genéticos.
Proteómica y Artritis Reumatoide.
En el futuro, los arrays de proteínas podrán aplicarse al diagnóstico clínico de la artritis reumatoide. Estos microarrays permitirán el análisis de la especificidad de la respuesta auto-antígenos contra el mismo grupo de auto-anticuerpos putativo en muchos pacientes de manera simultánea 24. De esta manera será posible crear perfiles de “auto-antígenos” para cada paciente e investigar las causas de que las nuevas terapias con TNF y anticuerpos anti-CD20 fracasen en algunos casos. También se podrá encontrar los antígenos inductores de la autoinmunidad gracias al uso de suero de modelos animales y de pacientes desarrollando su enfermedad reumática en estadíos iniciales 13,25.
Actualmente se utilizan técnicas como el Western blot (método para la detección de proteínas en una muestra de un tejido, que posteriormente se separan mediante electroforesis) y ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo inmuno-absorbente ligado a enzimas, detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos, cuya reacción puede ser medida mediante espectrofotometría) que deberán rediseñarse hacia microarrays de antígenos. Este proceso requerirá mucho tiempo hasta que sea perfeccionado, ya que sus múltiples etapas y la gran cantidad de información que generan hacen que el proceso y manejo de los datos requiera de avances tecnológicos 13.
Ya existen nuevos chips diseñados para la caracterización de alergias y enfermedades autoinmunes consiguiendo buenos resultados, o por lo menos mejores que con ELISA, pero tomará tiempo hasta que estas tecnologías puedan ser aplicadas para regular los ensayos clínicos 26,27.
Bibliografía.
1. Cooper GS, Stroehla BC, The epidemiology of autoimmune diseases. Autoimmun. Rev. 2003, 2 :119–125.
2. Bennet C, Plum F: Cecil Textbook of Medicine. 20ªed. EEUU, W.B. Saunders Company. 1996.
3. Isselbacher KJ, Braunwald E, Wilson J. HARRISON: Principios de medicina interna. Vol I. 13ªed. Madrid, Interamericana McGraw-Hill. 1994.
4. Choy E, Panayi G. Cytokine Pathways and joint Inflammation in Rheumatoid Artritis. N Eng J Med. 2001, 344:907-16.
5. Burmester GR, Häupl T. Strategies using functional genomics in rheumatic diseases. Autoimmun Rev. 2004, 3:541– 9.
6. Cheema GS, Roschke V, Hilbert DM, Stohl W. Elevated serum B lymphocyte stimulator levels in patients with systemic immune-based rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 2001, 44:1313–19.
7. Firestein GS, Alvaro-Gracia JM, Maki R, Alvaro-Garcia JM. Quantitative analysis of cytokine gene expression in rheumatoid arthritis. J Immunol .1990, 144(9):3347– 53.
8. Thomas JW, Thieu TH, Byrd VM, Miller GG. Acidic fibroblast growth factor in synovial cells. Arthritis Rheum . 2000, 43(10):2152– 9.
9. Zvaifler NJ. The immunopathology of joint inflammation in rheumatoid arthritis. Adv Immunol . 1973, 16(0):265 –336.
10. Kremer JM, Westhovens R. Leon M. Treatment of rheumatoid arthritis by selective inhibition of T-Cell activation with Fusion Protein CTLA4Ig. N Engl J Med. 2003, 349:1907-15.
11. Bovin LF, Rieneck K, Workman C, et al. Blood cell gene expression profiling in rheumatoid arthritis. Discriminative genes and effect of rheumatoid factor. Immunol Lett. 2004, 93: 217-26.
12. Krenn V, Petersen I, Häupl T, Koepenik A, Blind C, Dietel M, Konthur Z, Skriner K. Array technology and proteomics in autoimmune diseases. Pathol Res Pract. 2004, 200:95–103.
13. Krenn V, Morawietz L, Häupl T, Neidel J, König A. Grading of chronic synovitis—a histopahtological grading system for molecular and diagnostic pathology. Pathol Res Pract. 2002, 198(5):317– 25.
14. Heller RA, Schena M, Chai A, Shalon D, Bedilion T, GilmoreJ, et al. Discovery and analysis of inflammatory disease-related genes using cDNA microarrays. Proc Natl Acad Sci.1997, 94(6):2150– 5.
15. Van Der Pouw Kraan TC, van Gaalen FA, Huizinga TW,Pieterman E, Breedveld FC, Verweij CL. Discovery of distinctive gene expression profiles in rheumatoid synovium using cDNA microarray technology: evidence for the existence of multiple pathways of tissue destruction and repair. Genes Immun. 2003, 4(3):187 –96.
16. Häupl T, Burmester GR, Stuhlmqller B. New aspects of molecular biology diagnosis. Array technology and expression profile for characterization of rheumatic diseases. Z Rheumatol. 2002, 61(4):396– 404.
17. Morawietz L, Gehrke T, Frommelt L, Gratze P, Bosio A, Moller J, et al. Differential gene expression in the periprosthetic membrane: lubricin as a new possible pathogenetic factor in prosthesis loosening. Virchows Arch, 2003,443(1):57–66.
18. Ruschpler P, Lorenz P, Eichler W, Koczan D, Hanel C, Scholz R, et al. High CXCR3 expression in synovial mast cells associated with CXCL9 and CXCL10 expression in inflammatory synovial tissues of patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther. 2003, 5:R241.
19. Devauchelle V, Marion S, Cagnard N, Mistou S, Falgarone G,Breban M, et al. DNA microarray allows molecular profiling of rheumatoid arthritis and identification of pathophysiological targets. Genes Immun . 2004, 5:597 – 608.
20. Maas K, Chan S, Parker J, Slater A, Moore J, Olsen N, et al. Cutting edge: molecular portrait of human autoimmune disease. J Immunol. 2002,169(1):5– 9.
21. Gu J, Märker-Hermann E, Baeten D, Tsai WC, Gladman D, Xiong M, et al. A 588-gene microarray analysis of the peripheral blood mononuclear cells of spondyloarthropathy patients. Rheumatology. 2002, 41(7):759-66.
22. Nepom GT, Byers P, Seyfried C, Healey LA, Wilske KR, Stage D, et al. HLA genes associated with rheumatoid arthritis. Identification of susceptibility alleles using specific oligonucleotide probes. Arthritis Rheum. 1989, 32(1):15-21.
23. Lin SC, Yen JH, Tsai JJ, Tsai WC, Ou TT, Liu HW, et al. Association of a programmed death 1 gene polymorphism with the development of rheumatoid arthritis, but not systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 2004, 50(3):770– 5.
24. Bussow K, Cahill D, Nietfeld W, Bancroft D, Scherzinger E, Lehrach H, Walter G, A method for global protein expression and antibody screening on high density filters of an arrayed cDNA library. Nucleic Acids Res.1998, 26:5007-8.
25. Oertelt S, Selmi C, Invernizzi P, Podda M, Gershwin ME. Genes and goals: An approach to microarray analysisin autoimmunity. Autoimmun Rev. 2005, 4:414– 22.
26. Jahn-Schmid B, Harwanegg C, Hiller R, Bohle B, Ebner , Scheiner O, Mueller MW. Allergen microarray: comparison of microarray using recombinant allergens with conventional diagnostic methods to detect allergen specific serum immunoglobulin. Clin Exp Allergy. 2003, 33:1443–9.
27. Robinson WH, Steinman L, Utz PJ. Protein arrays for autoantibody profiling and fine-specificity mapping. Proteomics. 2003, 3:2077–84.