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Papillomavirus humano en pterigium de pacientes de Latinoamerica
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Autor: Dra. Ivis J. Graterol
Publicado: 11/06/2010
 

Pterigium es una patología conjuntival compleja debido a su manejo y recurrencia.

Objetivo: Relacionar las características clínicas y la presencia de papillomavirus humano (VPH) en pacientes con pterigium, Latinoamericanos.


Papillomavirus humano en pterigium de pacientes de Latinoamerica .1

Papillomavirus humano en pterigium de pacientes de Latinoamérica.

Ivis J. Graterol S. Médica Docente asociada del Departamento de Morfología Normal y Patológica. Universidad de Carabobo, Facultad de Ciencias de la Salud, sede Aragua. Venezuela

Zorella Blanco. Médica Oftalmóloga del Hospital de los Samanes, Aragua. Venezuela.

María Correnti. Jefa del Laboratorio de Genética Molecular. Instituto de Oncología y Hematología. MPPPS. Caracas, Venezuela.

Zoraya De Guglielmo. Investigadora adjunta Laboratorio de Genética Molecular. Instituto de Oncología y Hematología. MPPPS. Caracas, Venezuela.

Correspondencia

Dra. Ivis J. Graterol. Universidad de Carabobo. Facultad de Ciencias de la Salud, Sede Aragua.
Departamento de Morfología Normal y Patológica. Venezuela.

Palabras claves

Conjuntivas, Papillomavirus Humano, Pterigium, Reacción en Cadena de la Polimerasa, países Latinoamericano

Key Words

Conjunctiva, human papillomavirus, pterygium, polymerase chain reaction, Latinoamerican country.

Sección a la que se dirige el artículo

Artículos originales

Resumen

Pterigium es una patología conjuntival compleja debido a su manejo y recurrencia.

Objetivo

Relacionar las características clínicas y la presencia de papillomavirus humano (VPH) en pacientes con pterigium, Latinoamericanos.

Métodos

Se evaluaron 51 pacientes: Ecuador (25), Perú (12), Venezuela (8) y Guatemala (6), en el hospital los Samanes, Venezuela. Se realizó agudeza visual, keratometría, toma de presión intraocular y biomicroscopía. Para la detección del ADN y tipificación se empleó la reacción en cadena de la Polimerasa y el Kit de Multiplex PCR. 

papilomavirus_humano_pterigium/deteccion_vph_pcr

Detección de papillomavirus humano (VPH) mediante PCR con primers MY09/MY11 y Tipificación por PCR múltiplex en muestras de pacientes con pterigium
Carril 1-2: Muestras positivas para papillomavirus humano (VPH), presentando el producto de amplificación de 450 pb.
Carril 3-4: pacientes positivos para papillomavirus humano (VPH) genotipo 11 (144 pb) y 6 (263 pb).
Carril 5: Control positivo de la PCR multiplex; se observan las bandas de 144, 263, 413 y 601 pb, correspondientes a los tipos 11, 6, 33 y 16.
Carril 6: Marcadores de peso molecular de 100 pb. 

papilomavirus_humano_pterigium/tipificacion_pcr_multiplex.

Tipificación de papillomavirus humano (VPH) en muestras de pacientes con pterigium, mediante PCR multiplex.
Carril 1: Marcadores de peso molecular de 100 pb.
Carril 2: Control positivo de la PCR multiplex; se observan las bandas de 144, 263, 360 y 413 pb, de los genotipos 11, 6, 18 y 33.
Carriles 3: Pacientes positivos para papillomavirus humano (VPH) tipo 18
Carriles 4, 5,6 y 7: Pacientes positivos para papillomavirus humano (VPH) tipo 11
Carril 8: coinfección con papillomavirus humano (VPH) tipo 18 y 6

Resultados

De 51 pacientes evaluados, 39% femeninos y 60% masculino, 49% procedían de Ecuador, 23% Peruanos, 15% Venezolanos y 11% de Guatemala. No se encontró relación entre diagnosis de casos de pterigium primaria o recidivante, grados de biometría y procedencia de los pacientes. 47% de las muestras presentaron infección por papillomavirus humano (VPH). 70,83% resultaron de bajo riesgo oncogénico. 76,47% casos positivos correspondieron al tipo primario. Los tipos de papillomavirus humano (VPH) fueron 50% papillomavirus humano (VPH) 11 y 12,5% presentaron coinfección con tipos 11 y 6. El papillomavirus humano (VPH) 18 de alto riesgo oncogénico se presentó asociado a papillomavirus humano (VPH) 6 y 11 en 16,5% de casos.

Conclusiones

Los genotipos de papillomavirus humano (VPH) fueron mayormente de bajo riesgo oncogénico, se presentó coinfección con papillomavirus humano (VPH) tipo 18 con los genotipos 6 y 11. No se encontró relación entre los casos de pterigium positivos para papillomavirus humano (VPH)H agrupados según el riesgo oncogénico y la procedencia de pacientes, ni con variables primarias y recidivantes

Palabras claves: Conjuntivas, Papillomavirus Humano, Pterigium, Reacción en Cadena de la Polimerasa, países Latinoamericano

Introducción

La conjuntiva es una membrana mucosa que cubre la superficie interna de los parpados y la superficie externa del globo ocular. Permite el movimiento independiente de los parpados y del globo proporcionando mucus para la lubricación, además contiene tejido linfoide para la protección inmunológica (1). El epitelio conjuntival se deriva del ectodermo superficial. (1) (2).

El pterigium es una degeneración elastótica de la sustancia propia de la conjuntiva, resultando en la proliferación de tejido fibrovascular inicialmente sobre la esclera desplazándose hacia la córnea (3). Dicha patología conjuntival es una de las más comunes y complejas, debido a su difícil manejo, ya que el índice de recurrencia es elevado (4). Desde un punto de vista etiológico existen diversos factores involucrados, dentro de los cuales se encuentran los genéticos y los ambientales, que predisponen al desarrollo de pterigium.


Papillomavirus humano en pterigium de pacientes de Latinoamerica .2

Varios estudios han demostrado la existencia de anomalías moleculares, como la pérdida de la heterocigosidad en loci cerca de genes supresores de tumor y la sobre expresión de p53 en las células madres del limbo corneal así como también la inactivación de p53 ligada a la infección por papillomavirus humano (VPH) (5,6,7). Dentro de lo factores ambientales las personas expuestas a los rayos UVB, UVA, calor y polvo tienen una alta incidencia de desarrollar esta patología, al igual que existe mayor incidencia en aquellos países que se encuentran cerca del Ecuador (8).

Existen reportes que asocian la presencia de agentes virales en el desarrollo de pterigium como Herpes virus, VIH, y papillomavirus humano (VPH); no obstante sus implicaciones en la etiología de pterigium todavía permanece controversial (9) (10) (11). Otros estudios han detectado la presencia de papillomavirus humano (VPH)H en lesiones conjuntivales premaligna y malignas, como el carcinoma epidérmico de la conjuntiva, donde además se ha reportado que la carga viral de papillomavirus humano (VPH) es mayor en las lesiones premalignas (8) (9) (12). La neoplasia intraepitelial de conjuntiva y córnea (NIC) es el tumor maligno más frecuente de la superficie ocular, durante su evolución clínica la neoplasia intraepitelial de conjuntiva y córnea (NIC) progresa lenta y continuamente pudiéndose transformar en carcinoma escamoso (12).

El propósito del presente estudio fue evaluar las características clínicas de pacientes con pterigium provenientes de países latinoamericanos como: Ecuador, Guatemala, Perú y Venezuela, determinar su asociación con infección por virus papiloma humano, e identificar la población de mayor riesgo de presentar lesiones premalignas y malignas de la conjuntiva.

Materiales y métodos

Un total de 51 pacientes de Ecuador, Guatemala, Perú y Venezuela, incluidos en el Programa Misión Milagro, fueron evaluados bajo consentimiento informado en el hospital de los Samanes Venezuela. Se les realizó keratometría, toma de presión intraocular, biomicroscopía. Fue empleada la clasificación del pterigium de la Academia Norteamericana de Oftalmología (13), que lo divide en primario: que va a ser trasplantado por primera vez, recidivante, si ha recibido uno o más tratamientos quirúrgicos previos y de acuerdo a su extensión en grado I, II, III y IV, con respecto al crecimiento sobre la córnea y la distancia del eje pupilar. Las técnicas quirúrgicas empleadas en los pacientes fueron de acuerdo al grado y recurrencia del pterigium.

Un fragmento se colocó en buffer formol para el diagnóstico histopatológico, y otro fue congelado a -70oC para el diagnóstico molecular de VPH. Extracción del ADN: El sedimento celular de las muestras fue digerido en 100 µl buffer de lisis (0,1% sarcosina; 10 mM Tris HCl, pH 8) y 100 µl Proteinasa K (1mg/ml), incubando durante, al menos, 3 horas a 42ºC. El ADN fue extraído mediante separación v/v con cloroformo-fenol/isoamílico y precipitación con 2 ½ volúmenes de etanol absoluto frío; se resuspendió en agua libre de nucleasas y se determinó la concentración espectrofotométricamente. La detección del genoma de VPH se realizó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) (14), empleando los iniciadores genéricos MY09 y MY11. Se utilizaron los iniciadores PC04/GH20 para amplificar simultáneamente un fragmento del gen humano de β-globina como control interno de la integridad y calidad del ADN y ausencia de inhibidores de la RCP, obteniéndose un producto de 268 pb.

Se incluyó, además, un control negativo (mezcla de reacción + ADN de individuo negativo). Aproximadamente 1 µg del ADN fue añadido a la mezcla de reacción [0,4 µl dntp´s (100 mM); 0,2 µl de cada primer (100 mM); 6 µl de buffer Taq 10X; 4 µl de MgCl2 (50 mM); 0,5 µl (2,5 U) de Taq DNA polimerasa (Invitrogen); H2O libre de nucleasas hasta un volumen final de 40 µl]. La amplificación se realizó en un termociclador “Mini cycler” MJResearch (Ciclos: 4 min. a 94 ºC, 40 por [15 seg. a 94 ºC, 30 seg. a 55 ºC, 45 seg. a 72 ºC] y una extensión final de 7 min. a 72 ºC). La tipificación se realizó con el kit MP-70078 “MPCR Kits for Human Papillomaviruses” (Maxim Biotch, Inc.) que permite tipificar los tipos 6 y 11 de bajo riesgo, y los tipos 16, 18 y 33 de alto riesgo oncogénico. Los amplificados fueron visualizados mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.

Se realizo la relación de dependencia de variables cruzadas utilizando la prueba de independencia de Chi2, programa Statxact ® versión 8.0.Los datos fueron presentados en tablas de contingencia para su análisis.

Resultados

De los 51 pacientes evaluados, el 49% (25/51) procedían del Ecuador, 23% (12/51) de Perú, 15% (8/51) fueron venezolanos y 11% (6/51) de Guatemala. 60.7% fueron masculino y 39.2% femenino. El tipo de pterigium que se observó con mayor frecuencia fue el primario 76,6% (39/51) mientras que el recidivante se presento en un 23,5% (12/51). La distribución de los casos de pterigium según su procedencia y grado de biometría se presenta en la Tabla 1.

Tabla 1 

papilomavirus_humano_pterigium/frecuencia_procedencia_pterigium

Frecuencia de casos de según procedencia y tipo de pterigium

Tabla 2 

papilomavirus_humano_pterigium/frecuencia_procedencia_biometria

Frecuencia de casos de pterigium según procedencia del paciente y grado de biometría.

El mayor porcentaje de lesiones grado I, 39,2% (11/25) se observó en los pacientes de Ecuador seguido de 32,1% (9/12) de Perú y 17,8% (5/8) de Venezuela. El grado II se presentó mayormente en pacientes de Ecuador (60%) (14/25), mientras que valores iguales se observaron para Guatemala Perú y Venezuela (13%).

Tabla 3 

papilomavirus_humano_pterigium/riesgo_oncogenico_pterigium

Infección por papillomavirus humano (VPH) y riesgo oncogénico en pacientes con pterigium.

El diagnóstico molecular para detectar el genoma viral demostró que 47% (24/51) de las muestras presentaron infección por papillomavirus humano (VPH) y el 50,9% fueron negativas; una muestra resultó insuficiente para realizar la prueba. De los casos positivos para papillomavirus humano (VPH) el 70,83% (17/24) resultaron de bajo riesgo y 12,5% (3/24) de alto riesgo oncogénico, cuatro de las muestras positivas no se pudieron tipificar con la prueba utilizada en el estudio.


Papillomavirus humano en pterigium de pacientes de Latinoamerica .3

Tabla 4 

papilomavirus_humano_pterigium/tipificacion_VPH_pterigium

Tipificación de papillomavirus humano (VPH) en pacientes con pterigium por RCP multiplex.

El papillomavirus humano (VPH) tipo 11 se encontró en 50% (12/24) de las muestras, seguido de 12,5% (3/24) de infección con VPH tipo 6 y 11. Dos casos presentaron papillomavirus humano (VPH) de alto riesgo tipo 18 en coinfección con el tipo 6 y el tipo 11.

Tabla 5 

papilomavirus_humano_pterigium/hpv_oncogenesis_pterigium

Fuente: autores

Clasificación de papillomavirus humano (VPH) según el riesgo oncogénico y el tipo de pterigium.

Al relacionar la procedencia de los casos con la presencia de papillomavirus humano (VPH) no se observó diferencias significativas. Considerando solo los pacientes positivos para papillomavirus humano (VPH), clasificados según el riesgo oncogénico y relacionándolos con la procedencia de los casos de pterigium no se encontró diferencia.

Tabla 6 

papilomavirus_humano_pterigium/procedencia_riesgo_oncogenico

* Un caso fue insuficiente

Distribución de los pacientes según la procedencia y el riesgo oncogénico de VPH. VPH-riesgo oncogénico

Tampoco se observó relación de la infección con las variables primarias y recidivantes en los casos estudiados.

Discusión

Los estudios epidemiológicos indican que la exposición crónica al sol y más probablemente a los rayos ultravioleta (UV-B) son un factor importante en el desarrollo de pterigium. Investigadores han demostrado que los países cerca del Ecuador tienen un alto porcentaje de presentar esta patología y se ha demostrado de igual forma el efecto de activación que tiene los rayos UV-B sobre los virus tales como, el herpes simple, VIH y papillomavirus humano (VPH) (4, 10,15). Varios autores no han detectado presencia de infección por papillomavirus humano (VPH) en pterigium y en neoplasia epitelial maligna de la conjuntiva (16) (17). Numerosas evidencias soportan que la infección persistente por papillomavirus humano (VPH) constituye un factor de riesgo para el desarrollo de lesiones premalignas y malignas de cuello uterino (18). En Venezuela existen reportes de presencia de infección por papillomavirus humano (VPH) de alto y bajo riesgo oncogénico en lesiones benignas y malignas de otras localizaciones anatómicas como la cavidad bucal (19) (20).

En el presente estudio, la mayoría de los pacientes evaluados, pertenecían al género femenino y procedían de Ecuador (49%) A los pacientes se le realizó la prueba de biometría que permite evaluar las variaciones en los compartimientos intraoculares del paciente, que informa sobre el estado del ojo y aporta las medidas de los distintos compartimientos del globo ocular, además elementos para planificar las cirugías de este órgano (21), en este caso los grados I y II de biometría determinados por las medidas biométricas medias de la longitud axial, profundidad de la cámara anterior, el grosor del cristalino y la profundidad de la cámara vítrea, no presentó relación estadísticamente significativa con la procedencia de los paciente. La variable tipos de pterigium bien sea de aparición primaria o recidivantes se relacionó con el grado de biometría de los casos estudiados, no observándose asociación.

La frecuencia de infección por papillomavirus humano (VPH) en los pacientes evaluados, se ubicó en un nivel intermedio (47%), no alcanzando los valores reportados por Piras y col (8), con 100% de caso papillomavirus humano (VPH) positivos en pacientes italianos y no fue relativamente baja (21%) como la incidencia observada en pacientes de Ecuador, a pesar que en nuestro estudios el mayor número de pacientes provenían de ese país. Los casos VPH (+) fueron similares a los resultados de Gallagher y col (22) que reportó 50% de incidencia de papillomavirus humano (VPH) en pacientes del Reino Unido. La presencia de papillomavirus humano (VPH) se observó mayormente en las lesiones de aparición primaria esto podría sugerir que el papillomavirus humano (VPH) puede estar involucrado en la patogénesis del pterigium (15) (22).

En nuestros casos se observó la asociación de subtipos de VPH de bajo y alto riesgo oncogénico, en los pacientes con pterigium a diferencia de Detorakis y col. (11) que encontraron 15 casos con papillomavirus humano (VPH) tipo 18 en Grecia, y Dolmetsch y col. (23) reportaron VPH 16 en todos sus casos con pterigium estudiados en Canadá usando inmunohistoquímica. Adicionalmente el carcinoma conjuntival ha sido asociado con infección viral concomitante, principalmente con el VIH e infección por papillomavirus humano (VPH), en una proporción de casos estudiados en el África (24). Sin embargo otros autores no han detectado la presencia de papillomavirus humano (VPH), dejando no resuelta su posible participación (25) (26) (27). De mayor interés los casos recidivantes donde se observó el (23,5%) de positividad para VPH, destacando que pterigium tiende a recurrir en un 46% de los casos, después de una escisión, luego de 7 años, sumado a esto la persistencia de la infección por papillomavirus humano (VPH), podría relacionarse con la recurrencia del pterigium y la posible naturaleza neoplásica de la lesión. Un grupo de pacientes estudiados (16,6%) fueron positivos para la infección por papillomavirus humano (VPH), pero no se logró su tipificación, probablemente por ser subtipos no incluidos en la prueba molecular empleada para el diagnóstico molecular, similar a lo observado por Piras y col (8), que identificó tres tipos de papillomavirus humano (VPH) que se presentan con baja frecuencia, el VPH tipo 52, candVPH 90 y VPH 54 en su estudio por secuenciación del genoma viral.

Varios reportes han demostrado la presencia de infección viral en pterigium, otros sostienen que VPH no es un cofactor para su aparición sin embargo pudiera jugar un papel sinérgico en los múltiples pasos del proceso de su desarrollo.

La variedad de tipos de papillomavirus humano (VPH) en similares reportes, evidencia que existe una ocurrencia de la infección asociada a la presencia de genoma viral de alto riesgo oncogénico en pterigium; sin embargo existen diferencias en la detección de ADN-VPH de bajo riesgo así como de coinfección con más de un tipo de papillomavirus humano (VPH), haciendo que su participación en las lesiones premalignas de conjuntivas, todavía amerita ser investigada.


Papillomavirus humano en pterigium de pacientes de Latinoamerica .4

En el presente estudio, no se observaron diferencias significativas entre pacientes con pterigium VPH positivo y los negativos. Los genotipos de papillomavirus humano (VPH) fueron mayormente de bajo riesgo oncogénico, se presentó coinfección con papillomavirus humano (VPH) tipo 18 con los genotipos 6 y 11. No se encontró relación entre los casos de pterigium positivos para papillomavirus humano (VPH) agrupados según el riesgo oncogénico y la procedencia de pacientes, ni con variables primarias y recidivantes.

Agradecimiento

El estudio ha sido financiado por Proyecto Fonacit Proyecto G2005408 y el proyecto Sub 3 20070001088 Misión Ciencias.

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