Elaboración de una técnica automatizada y validación de la misma para la determinación de factor plaquetario (FP3)

Dr. José Luis Bracco, Bioquímico, Jefe de laboratorio GNLAB. Laboratorio GNLAB (Laboratorio Gamma Nuclear). General Galarza 1082/86, Concepción el Uruguay, Provincia de Entre Ríos, República Argentina.

Resumen:

El factor plaquetario 3 (FP3) es un fosfolípido de la membrana plaquetaria con una pronunciada carga superficial electronegativa de suma utilidad en el anclaje al sitio de la reparación. Es el principal promotor del mecanismo intrínseco de la coagulación de la sangre y su disposición se ve potenciada en presencia de caolín. La prueba de valoración de FP3 consiste en la recalcificación de un plasma rico en plaquetas (PRP) activado con caolín, efectuada con metodología automática en un autoanalizador.

Como sus valores están influenciados por la cantidad y calidad de las plaquetas, calidad de la agregación, de la activación, y de la membrana plaquetaria, y como las plaquetas tienen injerencia en todas las etapas de la coagulación, la determinación de FP3 resulta de suma importancia en la evaluación plaquetaria y hemostática y es una prueba cuantitativa de mejor performance que el tiempo de sangría y la retracción del coágulo, con las que está relacionada fisiopatológicamente.

Si bien el factor plaquetario 3 se ve evaluado indirectamente por el tiempo de coagulación, el tiempo de Howell, y el consumo de protrombina; la actividad procoagulante de las plaquetas o FP3 debería ser evaluada de manera directa mediante pruebas de mayor sensibilidad como las determinaciones coagulométricas, ensayos cromogénicos de actividad protrombinasa o por citometría de flujo.

Nosotros hemos elegido el método coagulométrico, optimizado por la automatización, que es más accesible para la generalidad de los laboratorios.


Abstract:

Platelet factor 3 (FP3) is a platelet membrane phospholipid with a pronounced electronegative surface charge extremely useful in anchoring the repair site. It is the main promoter of mecanimo intrinsic blood clotting and readiness is enhanced in the presence of kaolin. Proof of valuation of FP3 is the recalcification of platelet-rich plasma (PRP) activated with kaolin, completed with an automatic autoanalyzer methodology. As their values are influenced by the quantity and quality of platelets, as aggregation, activation and platelet membrane, as platelets have interference at all stages of coagulation, the determination of FP3 is extremely important in evaluating platelet hemostatic and is a quantitative test of better performance than the bleeding time and clot retraction, with which it is linked pathophysiologically.

Although platelet factor 3 is assessed indirectly by the clotting time, the time of Howell, and consumption of prothrombin procoagulant activity of platelets, or FP3 should be assessed directly by testing the most sensitive determinations coagulometers , chromogenic assay and prothrombina seactivityby flor cytometry.

We have chosen the method coagulometer, optimized for automation, which is more accesible to the generality of the laboratorios.

Palabras clave: factor plaquetario 3, caolín, tromboplastina intrínseca, recalcificación de PRP, agregación y activación plaquetaria, autoanalizador, especificidad, linealidad, precisión, exactitud.


Keywords: platelet factor 3, Kaolín, thromboplastin intrinsic recalcification of PRP, platelet aggregation and activation, autoanalyzer, specificity, linearity, accuracy, accuracy.

Introducción:

Las plaquetas al ser sometidas a distintos estímulos liberan una lipoproteína de membrana, el factor plaquetario 3 (FP3), necesaria para la conversión intrínseca de factor II (protrombina) en factor II activo (trombina). La liberación puede lograrse por fragmentación mecánica o por caolín. La primera dejaría mayor cantidad de FP3 disponible, pero el caolín libera un 25 a 30% de FP3 que es lo que ocurre fisiológicamente durante la coagulación normal. La incubación de plasma rico en plaquetas (PRP) con caolín produce también la activación de los factores XI (antecedente tromboplastínico plasmático) y XII (factor Hageman) que actúan como tromboplastina intrínseca.

Si el tiempo de tromboplastina parcial (KPTT) de la muestra en estudio es normal, se emplea PRP del propio paciente para evaluar FP3, si el KPTT es anormal se pueden usar, si se prefiere, plaquetas del paciente y plasma pobre en plaquetas (PPP) de un dador normal 1 en la proporción 1:8 de PRP autólogo y 7:8 de PPP heterólogo. 2 De cualquiera de las formas se obtienen datos interesantes para considerar, siempre y cuando se determine el FP3 como una prueba más dentro del coagulograma, o si se evalúa conjuntamente con el tiempo de tromboplastina parcial (KPTT).

La determinación consiste en una prueba de recalcificación del plasma rico en plaquetas de los especímenes en estudio activados por caolín, conocida por los anglosajones como PF3 time; y universalmente como Prueba de Spaet o Tiempo de Stypven.

De las cuatro fases de la coagulación: vascular o fase 1, plaquetaria o fase 2, sanguínea o fase 3, y fibrinolítica o fase 4; la determinación de FP3 tiene relación con la fase de liberación que ocurre inmediatamente después de la agregación plaquetaria, e inicia la fase sanguínea o coagulación propiamente dicha. Por lo que sus valores estarán influenciados por la cantidad y calidad de las plaquetas, calidad de la agregación, de la activación y de la membrana plaquetaria.

La trombostenina, proteína plaquetaria contráctil necesaria para la retracción del coágulo, está involucrada también en la reacción que conduce a la agregación plaquetaria, y puede proveer puentes interplaquetarios durante la agregación, por lo que es probable que defectos en la disposición o en la calidad de la trombostenina estuvieran también asociados a disminución del FP3. 3

Es de esperar, entonces, que patologías asociadas con una retracción del coágulo anómala cursen con alteraciones del FP3 time.

La fisiología de la retracción del coágulo ex vivo tiene algunas variantes insospechadas que no hemos encontrado descriptas en ninguna bibliografía. Resulta interesante, por ejemplo, observar que en PRP inducidos con FP3 exógeno (heterólogo) o con su sustituto cefalina-caolín, la retracción del coágulo se completa en 60 minutos, mientras que en PRP inducidos con caolín para la generación de FP3 autólogo, no ocurre la retracción del coágulo. Tampoco se produce la misma en la recalcificación de un PPP según Howell, lo cual era de esperar y demuestra la importancia del rol plaquetario en la retracción.

Las plaquetas son necesarias para la coagulación sanguínea propiamente dicha y en su ausencia generalmente, aunque no siempre, el tiempo de coagulación aumenta, obteniéndose valores de 1.4 veces más largos para los tiempos de Howell efectuados sobre PPP respecto a los efectuados sobre PRP. Es decir que las plaquetas condicionan la fase 2 plaquetaria y la 3 sanguínea, pero además, por contener antiplasmina, proteína que inhibe la lisis de coágulos de fibrina, ejercen un rol de importancia en el mecanismo de la fibrinolisis, es decir en la fase 4. Los productos de degradación de la fibrina generados tienen, a su vez, poder de agregantes plaquetarios. 3

Por eso, en aquellas situaciones que transcurren con un incremento de los monómeros de fibrina, sería de esperar una hiperagregación plaquetaria y alteraciones del valor de FP3. Por lo tanto, además de las patologías que cursan con alteraciones de la agregación plaquetaria y de la retracción del coágulo, resultaría de interés evaluar los valores de FP3 en situaciones como el embarazo, o la coagulación intravascular diseminada (CID), que suele cursar con valores elevados de monómeros de fibrina.

Las plaquetas, ricas en serotonina, cuya acción biológica es vasoconstrictora, también tiene injerencia en la fase 1 o vascular de la coagulación.

Las plaquetas se adhieren al colágeno, al subendotelio y a las superficies artificiales. No se adhieren al endotelio ni a las células endoteliales normales, pero sí a las células endoteliales activadas por adrenalina, trombina, ADP e inmuncomplejos. 3

La activación de las plaquetas, adheridas al colágeno, condiciona físicamente la transformación de su normal morfología discoide en una morfología esferoide. Es entonces cuando el denominado factor plaquetario 3 se exterioriza en la superficie de la membrana plaquetaria, en tanto que en las plaquetas inactivas se encuentra ubicado en la cara interna de dicha membrana. La superficie de las plaquetas activadas, adheridas y agregadas sobre la brecha del endotelio vascular queda dispuesta, recubierta por el factor plaquetario 3, para que sobre ella se realice la siguiente fase de la coagulación. 4

Desde este punto de vista, el FP3 tendría una función de importancia en el anclaje de las plaquetas y del tapón hemostático en la zona del endotelio dañado, ya que las cargas electronegativas del FP3 interactúan con las cargas positivas del colágeno expuesto en el daño endotelial. Niveles bajos de FP3 dificultarían la correcta formación in situ del tapón hemostático, facilitando el sangrado.
Otros autores han señalado que el factor plaquetario 3 disminuye en la enfermedad de Von Willerand, en trombopatías, en hepatopatías, en la uremia, disproteinemias, escorbuto 1. En muchos trastornos mieloproliferativos como la trombocitopenia, la policitemia, la leucemia mieloide crónica y en la metaplasia mieloide, se encuentran trastornos funcionales de las plaquetas con aumento del tiempo de sangría, defecto de la agregación plaquetaria, liberación anormal y defecto del FP3.

En la uremia el tiempo de sangría está aumentado, mientras que la agregación plaquetaria y el FP3 están disminuidos. 5

Schwartz y cols. (1974) han comunicado la asociación de deficiencia de FP3 y deficiencia de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa.

En la enfermedad del pool de almacenamiento a veces se observa una disminución de FP3 disponible.

En el síndrome de Bernard-Soulier (1948) la disposición de FP3 es pobre cuando se mide por la prueba de consumo de protrombina, pero es normal por el método del caolín (Cullum y cols, 1967) 6
Se observó púrpura trombocitopénica crónica en 2 hermanos del sexo masculino. Se consideró que se trataba de una enfermedad determinada genéticamente, porque en el paciente 2 se demostró disgammaglobulinemia y nivel bajo de factor plaquetario 3, y porque al estudiar a la familia se encontró un cuadro semejante desde el punto de vista de laboratorio en un primo hermano por la rama materna y se demostró disgammaglobulinemia en varios parientes de la misma rama. Se consideró que probablemente se trataba de una entidad transmitida por un gene anormal del cromosoma X y se consideró que hay bases suficientes para formar un grupo con estos 2 enfermos y los descritos por Shaar, Vastermark y Canales bajo el nombre de forma atenuada de síndrome de Wiskott-Aldrich. 7

En todos estos casos ocurre una disminución del FP3 liberado por las plaquetas lo que se traduce en un aumento del tiempo requerido para que se forme el coágulo del PRP activado con caolín (FP3-time). El resultado se expresa en segundos.

Nosotros hemos observado una disminución del FP3 en dos pacientes de sexo femenino con anticoncepción oral, con FP3-time de 83.92 y de 69.04 segundos, respectivamente, con valores de referencia de 33.7 a 56.8 segundos.

Un paciente de sexo masculino concurrió a efectuarse un control prequirúrgico, para una intervención vascular de miembros inferiores, y hemos encontrado un FP3 disminuido con valores de FP3-time de 64.10 segundos.

También hemos observado un discreto aumento de FP3 (disminución de PF3-time) de 32.90 segundos, en un paciente con cantidad y agregación plaquetaria normal. Se trataba de un cardiópata anticoagulado oralmente, con un tiempo de protrombina de 26.72 segundos, RIN 2.26 , KPTT ligeramente aumentado de 45.19 segundos , retracción del coágulo disminuida (38.75%) debido a una hipofibrinogenemia discreta (126.17 mg/dl), normalidad de las pruebas globales de coagulación, en especial del Howell en PRP (96.53 segundos; con valor de referencia de 70-170 segundos) y en PPP (178.7 segundos;con valor de referencia de 100-280 segundos), y plaquetas normales (201.000/µl; valor de referencia de 100.000-300.000/µl) , con agregación plaquetaria normal (57%; valor de referencia de 25-78%) y activación plaquetaria aumentada (18%; valor de referencia de 5-10%). Por lo que los valores aumentados de FP3 y la activación plaquetaria estarían indicando, acaso, el estado de hipercoagulabilidad de base del paciente.

Diversos aspectos de la función de las plaquetas han sido estudiados extensamente, aunque en la literatura existen pocos trabajos sobre la actividad procoagulante de las plaquetas en pacientes diabéticos. 8

Toleran y colaboradores. 8, encontraron un aumento de factor plaquetario 3 en pacientes diabéticos con y sin manifestaciones vasculares, en comparación con sujetos sanos.

En definitiva, como la activación plaquetaria predispone las moléculas de FP3 y la agregación plaquetaria induce la liberación de agentes plaquetarios activos, entre ellos los fosfolípidos de membrana FP3, deberemos estudiar los valores de FP3 en condiciones de activación plaquetaria disminuida y aumentada y de agregación plaquetaria disminuida y aumentada, es decir en estados de hipo e hipercoagulación inducida por las plaquetas. Entre los segundos debe recordarse que el embarazo se ha incluido en el grupo de las llamadas trombofilias adquiridas y que muchos autores han sugerido la conveniencia de una discreta anticoagulación oral para prevenir la microangiopatología diabética.

Nosotros hemos estudiado la agregación plaquetaria en distintas situaciones clínicas habiendo concluido que se encuentra agregación plaquetaria disminuida en: dislipemia, hipercolesterolemia, Parkinson, hipertensión e hipotensión arterial, parestesias, dolor precordial, hipotiroidismo en tratamiento, poliartralgias, osteoporosis, hipoglucemia, anemia, microhematurias, hipertiroidismo, gestación después de 26 semanas, puerperio con lactación, intolerancia a lácteos y farináceos, gastroenteropatías, ictericia leve, etilismo, prurito generalizado, leucopenias y leucocitosis, prostatismo, cáncer de próstata, úlceras crónicas de la piel, síndrome gripal, disfunción mitocondrial.

Por otro lado, se encuentra una agregación plaquetaria aumentada en: dermatitis atópica, alergia, broncoespasmos, cáncer renal, pérdida de peso, hipertensión arterial (HTA), angioma, colecistitis, tendinitis.

La activación plaquetaria aumentada la hemos observado en: infecciones urinarias en pediatría y en pneumopatías infecciosas (18 y 24% de plaquetas activadas, respectivamente), en gestantes (17.1% de activación plaquetaria promedio en el 100% de los especímenes estudiados).

En el 66.66% de diabéticos hemos encontrado gran activación plaquetaria (33.3%), en la obesidad (20%), en el tabaquismo aumenta la agregación y la activación plaquetaria, en el 54.5 % de especímenes anémicos se observa activación plaquetaria aumentada y en el 60% de los casos de hipotiroidismo.

En el déficit familiar del factor plaquetario 3 se encuentra alargado el tiempo de sangría, con presencia de plaquetas grandes. Todas las funciones dinámicas plaquetarias (adhesividad, agregación con ADP, agregación con colágeno, retracción del coágulo) son normales, pero se encuentra un déficit de factor plaquetario 3 con repercusión sobre la coagulación plasmática. Se ha interpretado la anomalía plaquetaria como un engrosamiento de la membrana (paquidermia plaquetaria) que dificultaría la liberación de factor 3.

La enfermedad de Von Willebrand presenta alteraciones en la calidad de las plaquetas, déficit de factor 3 y disminución de la adhesividad y agregación. En la macroglobulinemia de Waldenström y en el mieloma múltiple el anclaje de globulinas anómalas sobre la membrana plaquetaria impide la liberación de factor 3.

El factor plaquetario 3 se ve evaluado indirectamente por el tiempo de coagulación y el consumo de protrombina 9. Esta última prueba evaluatoria del sistema intrínseco de la coagulación, constituye una manera indirecta de medir la tromboplastina intrínseca. Esta proteína debe actuar sobre toda la protrombina para convertirla en trombina. Si la producción de tromboplastina intrínseca resulta insuficiente, no toda la protrombina pasa a trombina y queda en el suero un remanente que puede valorarse. Existen disponibles dos tipos de métodos de medida de la protrombina residual, uno cualitativo y otro cuantitativo que es la determinación de factor II en una muestra de suero pero procediendo como si fuese plasma. 1-102.

La actividad procoagulante de las plaquetas o FP3 puede y debe estudiarse de manera directa mediante pruebas coagulométricas, ensayos cromogénicos de actividad protrombinasa o citometría de flujo. 10-529

Nosotros hemos elegido el método coagulométrico, optimizado por la automatización, que es más accesible para la generalidad de los laboratorios.

Materiales y métodos

Materiales: Plasma rico en plaquetas, caolín, cloruro de calcio 0.025M para técnicas de hemostasia, autoanalizador Metrolab 2100 made in argentina.

Muestra: 300 µl de PRP a las 2 horas de la extracción sanguínea + 30 µl de caolín + vortex suave + 5 minutos a temperatura ambiente.

Reactivo: Cloruro de calcio 0.025 M, caolín (solución saturada en agua destilada)

Técnica: Automática

Ficha técnica del autoanalizador M2100.

Tipo de técnica (5): (Tiempos)
Referencia (1): Factor
Longitud de onda: (660) nm
Referencia dicromática: (000) nm
Unidades: (segundos)
Volumen de la muestra: (200 µl)
1º reactivo: (200 µl)
2º reactivo: (0)
1º incubación: (10 minutos)
2º incubación: (0)
Límite inferior: (30)
Límite superior: (60)
L.bl/sustrato: (0.200)
Consumo/minuto: -
Factor: (1)
Cálculo: (1)

Parámetros del autoanalizador M 2100:

Tmax: Tiempo máximo de lectura en segundos, por ejemplo 600 segundos.

Umbral: Es la diferencia de lectura en absorbancias entre el plasma sin coagular y coagulado, por ejemplo 0.050.

Es decir, que dentro de los 600 segundos, toda variación de absorbancias del aparato igual o superior a 0.050, disparará el stop, concluirá la reacción y medirá el tiempo que ha tardado en coagular el plasma. Es conveniente fijar tiempos máximos altos de modo que el método logre medir plasmas muy anticoagulados.

Resultado:

1) Obtención del rango de referencia del método:

Performance intraensayo: en una corrida de una mezcla de 4 plasmas ricos en plaquetas de pacientes sin trastornos evidentes de la coagulación, efectuada a las 2 horas de las venipunciones, hemos obtenido los siguientes valores de FP3: 53.05; 49.09; 48.22; 47.33; 44.69; 44.26; 43.83; 39.87; 39.42; con un media de 45.36, una DS de 4.17 segundos, y un CV intraensayo de 9%. El valor de referencia, sumando y restando a la media 3 DS, es de 32.83-57.88

El CV intraensayo para un método inmunorradiométrico (IRMA) para la determinación de antígeno específico prostático (PSA), de sensibilidad y especificidad reconocidas universalmente, es de 7.1% según los datos aportados por el fabricante.

Performance interensayos: al estudiar la linealidad del método, que veremos más adelante, hemos obtenido que el intervalo de referencia para las muestras no patológicas, según una valoración interensayos, vendría dado por la media de los puntos de las diluciones 1:1, correspondiente a muestras de distintos plasmas sin diluir procesados en días diferentes, menos 3 DS y más 3 DS; es decir 44.90 más menos 11.19, o sea 33.70 a 56.80, que coincide con los valores anteriormente expuestos y con los valores de referencia del tiempo de tromboplastina parcial (KPTT), que es un FP3-time no autólogo. Por lo tanto definimos como valor normal para FP3, por el método coagulométrico expuesto, el rango de 32.83-57.88 ó, aproximando, de 30 a 60 segundos.

El CV del método en el control interensayo fue de 8.30%. Mientras que la media de los CV de las determinaciones de 14 analitos de química clínica y enzimología, evaluados en un control de calidad externo, y por lo tanto interensayo, efectuado en la provincia de Entre Ríos, República Argentina, en febrero del 2010 fue de 12.64%; donde se observa claramente la excelente performance del método propuesto para la evaluación de FP3.

La determinación inmunorradiométrica de PSA en controles interensayos posee, según el fabricante, un CV del 6.00%.

Comparación con la performance de equipos comerciales empleados en la evaluación de la Coagulación y la Hemostasia: en los Kit de reactivos empleados para la determinación del tiempo de tromboplastina parcial y del estado del sector intrínseco de la coagulación, los fabricantes han evaluado como performance del método la reproducibilidad del mismo a distintas concentraciones del analito, procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día, y obteniendo para el valor de 45 segundos una DS de 1.1 segundos y un CV de 2.5%; y para el nivel de 62 segundos, una DS de 1.8 segundos y un CV de 3.0%. Esta dispersión de valores resulta menor a la obtenida por nuestro método en la determinación de FP3, pero se debe considerar que la determinación del factor procoagulante de las plaquetas o FP3 es una prueba dinámica, que involucra la inducción de un proceso biológico de generación de FP3.

De todas maneras resulta aceptable, en la validación de un método, toda DS intraensayo menor al 5.00 en la zona de valores fisiológicos, y la DS intraensayo obtenida por nosotros es de 4.17 segundos con un CV del 9.00% en esa zona de la curva dosis respuesta; y toda DS menor al 10 en los controles de rangos fisiológicos interensayo, y nuestro método posee una DS de 3.73 con un CV de 8.30%, para el control interensayo.

Comparación con la performance de distintos equipos comerciales empleados en un control de calidad externo interlaboratorial:

En controles de calidad interlaboratorios efectuados por el Colegio de Bioquímicos de una provincia de la República Argentina en el año 2010, se obtiene en el tratamiento estadístico de los resultados informados por todos los participantes para una muestra mensual tomada al azar, un CV mínimo de 2.92% para la determinación de sodio en suero, con una DS de 4.60; y un CV máximo de 27.17% para la determinación de transaminasa glutámico pirúvica, con una DS de 13.34

Un CV por sobre el 10.00 % se obtuvo para las determinaciones de urea (CV: 11.16%), creatinina (CV:14.55%), uricemia (CV:11.00%), triglicéridos (CV: 12.18%), transaminasa glutámico oxalacética (CV: 24.30%), fosfatasa alcalina (CV:17.46%), amilasa (CV:20.26%), creatinfosfoquinasa (CV: 22.42%), y fosfatemia (CV: 14.45%). De 18 analitos procesados, el 56%, es decir 10 analitos, poseen CV mayor a 10%; contra un 44% con mejor performance.

Recuérdese que el CV interensayo de nuestro método de terminación de FP3, fue de 8.30%, es decir con una buena performance.

Más adelante veremos que la DS y el CV intraensayo es menor a la DS y el CV interensayo. En el primero una misma muestra se procesa diez veces en la misma corrida, es decir, en similares condiciones del ensayo; en el segundo se procesan 10 alícuotas de una misma muestra en distintas corridas, como ocurre en los controles de calidad externos, aunque en este caso concurre también la diferencia de metodología y de aparatología; aunque tiene el beneficio estadístico del gran número de muestras.

En general se admite que DS arroje valores menores a 5.00 en la zona de concentraciones fisiológicas, y de 10.00 en las zonas de concentraciones 3 ó 4 veces superior, intraensayo, lo cual cumple nuestro método de determinación de factor plaquetario 3, cuya DS es de 4.17; o DS menores de 10.00 y de 30.00, respectivamente, en la evaluación del comportamiento interensayo, lo cual también cumplimenta nuestro método con un CV de 8.30%

El cumplimiento de tales parámetros validarían el ensayo.

Validación de la técnica:

1-Especificidad: Se define como la capacidad de un método analítico para medir exacta y específicamente el analito sin interferencias de impurezas, productos de degradación 11, o especímenes químicos o biológicos de reactividad química o de biorreactividad parecida. Se expresa como el grado de inexactitud del método 12. Rampazoo recomienda el análisis de muestras del analito sometidas a condiciones de degradación artificial hasta el 20% de degradación, lo cual constituye un criterio de especial interés cuando se desconocen los productos de degradación. 13

Nosotros hemos comprobado, procesando en la misma corrida el mismo espécimen de PRP con y sin agregado del 10% de caolín, que éste, en el término de 5 minutos, induce la liberación de una cantidad tal de FP3 y de antecedente tromboplastínico plasmático que acelera la recalcificación del plasma a más del doble su velocidad, de tal manera que se obtienen tiempo de alrededor de 45 segundos, contra 105 del PRP sin caolín. Un tiempo intermedio de 71.74 segundos se obtiene incubando el PRP con caolín durante 3 minutos, y 48.15 segundos cuando se lo incuba 5 minutos, demostrándose de este modo la generación de FP3 y de antecedente tromboplastínico plasmático, descriptas por otros autores, durante la incubación del PRP con caolín.

También hemos observado que la agitación excesiva en vortex del PRP luego del agregado del caolín incrementa la cantidad de FP3 liberado, de tal manera que se sugiere una agitación muy suave para mezclar PRP y caolín, de modo de independizar las pruebas de esa variable. La agitación excesiva del PRP sin caolín durante 30 segundos, por su parte, no acelera el tiempo de recalcificación, por lo que se tendría que reconsiderar el grado del efecto mecánico como causa de liberación de FP3 plaquetario.

A distintas alícuotas de la muestra de PRP sin caolín se le añade 5, 10, 15, 20, 25, 30 µl de FP3 exógeno o su sustituto cefalina-caolín y se evalúa los tiempos obtenidos al recalcificarlos. En el tubo donde se obtenga un tiempo semejante al obtenido para los FP3 de plasma normal, se asumirá que el FP3 exógeno añadido es del orden del 27.5%, que es el promedio entre el 25 y el 30% de FP3 liberado en la inducción con caolín, considerado como niveles fisiológicos por otros autores. Con 1:4 del volumen de FP3 exógeno añadido a ese tubo, es decir con un 25% de impurezas o interferentes, se estudiará el sistema PRP+caolín+5 minutos+ 1:4 de FP3, y se definirá la especificidad del método en términos de inexactitud. Si ese 25% de FP3 exógeno fuera previamente sometido a degradación, y al ser añadido al sistema el método no lo detecta o lo hace mínimamente, estaríamos ante la presencia de un método bastante o muy específico. Si ese 25% de FP3 exógeno se añade al sistema sin degradar y el método lo detecta con una respuesta lineal respecto a la curva obtenida con FP3 endógeno, estaríamos ante la presencia de un método específico para FP3. Nosotros elegimos esta segunda opción ya que en la misma sabemos lo que agregamos al sistema y lo que medimos.

Resultados:

Una mezcla de PRP de cuatro pacientes aparentemente normales se procesó a las 2 horas, aproximadamente, de la extracción sanguínea,

preparando 10 tubos plásticos con alícuotas de 300 µl de PRP, a las que se añadió 5, 10, 15, 20, 25 y 30 microlitros de FP3 exógeno o su equivalente en cefalina-caolín. Se obtuvieron los siguientes resultados, respectivamente: 73.82; 58.33; 50.42; 45.15; 35.92; 30.65 segundos.

La muestra correspondiente al agregado de 20 µl de FP3 exógeno, que coaguló a los 45.15 segundos, se correspondió con el FP3 plaquetario inducido por el caolín en PRP normales, con una media de 45.36; el valor de 30.65 segundos correspondiente a 30µl de FP3 exógeno (20 µl + 50%), se podría tomar experimentalmente como un estándar correspondiente a 50% veces más de la media, es decir un St 150%, y el resultado que arrojó en la corrida fue de 30.65 segundos.

El 25% de los 20 µl, es decir 5 µl, será tomado como impureza a los fines de evaluar la especificidad del método en términos de inexactitud, en el sistema integrado por 0.3 ml de PRP+5 µl de FP3 exógeno + 30µl de caolín.

Se añadió 5 µl de FP3 exógeno sin degradar a una serie de tubos conteniendo cada uno 300 µl de PRP correspondientes a un paciente aparentemente normal + 30µl de caolín. Se procesaron en el autoanalizador obteniéndose los siguientes resultados: 51.30, 49.30, 42.20, 35.80, 28.50; con una media de 42.78, una DS de 8.09 y un CV de 18.9%, casi el doble de dispersión del método original. La media bajó, con el añadido del interferente, de un valor de 45.36 a otro de 42.78, es decir 2.58 segundos, correspondientes a un error agregado de 5.69%. La DS del método con el interferente es de 8.09, que resulta menor al límite máximo permitido de 10.00 para concentraciones altas del analito en corridas intraensayos, menor también a 3 DS (4.17 x 3 = 12.51) del ensayo sin el interferente.

Trazada la curva dosis- respuesta correspondiente, graficando en el eje de las abscisas las concentraciones (en % del normal) 12.5, 25, 33.33, 50, 100, 125 y 150%, y los tiempos en que se produjo la coagulación en el eje de las ordenadas, se obtiene una función perfectamente lineal desde la concentración correspondiente al 50% del normal hasta la concentración correspondiente al 150% del normal, por lo que queda demostrado que el método detecta específicamente FP3.

2- Linealidad: Es la capacidad del método analítico para obtener resultados directamente proporcionales a la concentración del analito en un rango determinado. Se determina procesando diluciones progresivas de la muestra ya lista para dosar, y controles de concentración inferior y superior a lo normal si los hubiese, en un rango entre 50 y150% del normal.

Diluciones ya listas para dosar significa diluciones efectuada a los cinco de incubación del PRP con caolín, con solución fisiológica.

No disponemos de controles correspondientes a los valores superiores al 100% con niveles establecidos, de tal manera que nos limitaremos a estudiar la curva para valores inferiores al 100%, aunque se podría usar el agregado de 30 µl de FP3 exógeno como standard 150%, según hemos visto anteriormente.

Es de esperar una relación dosis-respuesta no lineal, a juzgar por el comportamiento de la curva dosis-respuesta en la determinación del porcentaje de actividad del tiempo de protrombina, que también es un método coagulométrico.

Se efectuarán diluciones 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 y 1:32 de PRP en solución fisiológica. El estudio de la linealidad se realiza durante 3 días. La curva de regresión se determina sobre los puntos individuales, graficándose en el eje de las abscisas las diluciones sucesivas y en el eje de las ordenadas la respuesta analítica, es decir, los tiempos obtenidos.

Dentro de la linealidad nos interesa conocer el coeficiente de regresión que viene dado por la pendiente de la gráfica. Este indica la sensibilidad del método y se expresa en unidades de respuesta sobre unidades de dosis. La sensibilidad analítica, es decir, la mínima dosis del analito capaz de detectar el método, es inversamente proporcional a la capacidad del método de detectar pequeñas diferencias en la dosis del analito, y se obtiene dividiendo la pendiente de la curva de calibración por la desviación estándar de las respuestas en cada punto o concentración. Se considera que a mayor pendiente mayor sensibilidad, es decir, que pequeñas variaciones de dosis en abscisas dará grandes variaciones de respuesta del instrumento en ordenadas. Mientras más pequeño sea el coeficiente de variación de la pendiente mayor será la linealidad, de tal modo que valores mayores al 5 % indican falta de linealidad.

Referimos los valores obtenidos para las cuatro primeras diluciones solamente, pues para diluciones mayores a 1:16 y, fundamentalmente, a 1:32, se altera la naturaleza y consistencia del coágulo obtenido por lo que se sale de las condiciones pre establecidas del método y se modifica el indicador del punto final de la reacción produciendo valores erráticos; y son, por otra parte, diluciones muy por debajo del 50% del valor fisiológico, límite inferior recomendado por otros autores.

La performance de un método en que la reacción no es lineal consta, generalmente, de la evaluación de: a) reproducibilidad b) límite de detección.

La reproducibilidad se evalúa calculando la precisión del método a distintas concentraciones, determinando la DS y el CV intraensayo y total. El límite de detección, por su parte, es la mínima cantidad de analito capaz de ser detectada como una muestra distinta de cero, y vendría representada por la ordenada al origen, o por la media de una serie de medidas del blanco de reactivos del método, más o menos 3 DS.

La ordenada al origen, es decir el valor de la respuesta para la dosis cero de FP3 endógeno y/o exógeno, corresponde a los valores del tiempo de recalcificación del plasma o tiempo de Howell en PRP, que cuando se efectuaba a las dos horas de la extracción sanguínea arrojaba una media de 190 segundos con una DS de 30 segundos, y un valor de referencia de 100 a 280 segundos.

La DS de la ordenada al origen sería 30 segundos y la sensibilidad del método en esa zona de muy baja concentración sería de 190/30, es decir de 6.30 segundos.

La mínima concentración capaz de detectar el método es la inversa de la sensibilidad, es decir 0.16, lo que representa el 16% del normal.

Resultados:

Corrida 1 de 3:
Dilución 1:1 ………………….….41.00 segundos
Dilución 1:2 ……………….…… 61.17 segundos
Dilución 1:4 …………………….. 98.31 segundos
Dilución 1:8 …………………….. 144.0 segundos

Corrida 2 de 3:
Dilución 1:1 ……………….…… 48.44 segundos
Dilución 1:2 …………………….. 60.20 segundos
Dilución 1:4 …………………….. 91.77 segundos
Dilución 1:8 ……………………. 128.6 segundos


Corrida 3 de 3:
Dilución 1:1 …………..…… 45.25 segundos
Dilución 1:2 ……………….. 68.10 segundos
Dilución 1:4 ………………. 114.60 segundos
Dilución 1:8 ………………. 257.90 segundos
Dilución 1:16 …………….. 311.90 segundos

Como hemos explicado recientemente diluciones mayores a 1:8 no alcanzan a producir un coágulo firme variando las condiciones de detección del ensayo.

La media para el punto 1:1 es de 44.90, la DS es de 3.73, el coeficiente de regresión es de 44.49, y la sensibilidad del método en esa zona es de 12.04; la media para el punto 1:2 es de 63.16 la DS 4.31, el coeficiente de regresión es de 31.58 y la sensibilidad es de 7.33; la media para el punto 1:3 es de 79.06, con una DS de 2.25, un coeficiente de regresión de 26.25 y la sensibilidad de 11.67; la media de la dilución 1:4 es de 101.56, la DS es de 11.76, el coeficiente de regresión es de 25.39 y la sensibilidad del método de 2.16; la media para el punto 1:8 es de 176.83, la DS 70.63, el coeficiente de regresión es de 22.10 y la sensibilidad de 0.31; es decir, el método es mucho más preciso (menor DS) y más sensible en las diluciones menores, hasta 1:3, que en diluciones mayores; siendo muy impreciso y poco sensible en el punto 1:8

Los valores obtenidos para 125% del normal son de 51.30, 49.30, 42.20, 35.80, 28.50; con una media de 42.78, una DS de 8.09, casi el doble de dispersión del método original, el coeficiente de regresión es de 34.22 y la sensibilidad del método en esa zona de 4.23.

El coeficiente de variación es la inversa de la sensibilidad del método y es 15.1% para el punto 125%, de 8.30% para el punto 100% ó 1:1; de 13.6% para el punto 50% ó 1:2; de 8.50% para el punto 33.33% ó 1:3; de 46.3% para el punto 25% ó 1:4.

Valores de alrededor de 5% del coeficiente de variación entre dos puntos, o menores, nos habla de la linealidad del método entre los mismos, por lo que en nuestro caso el método sería lineal hasta la dilución 1:3 inclusive, es decir para FP3 time de hasta 79.06 más menos 3 x 2.25 segundos aproximadamente, es decir 85.81 segundos que sería el límite máximo para el 33.33% del normal. Valores superiores de FP3 time requerirán la comparación con estándares de concentraciones más bajas.

Como a hemos dicho, el intervalo de referencia para las muestras no patológicas vendría dado por la media del punto 1:1 más menos 3 DS, es decir 44.9 mas menos 11.9, o sea de 33.7 a 56.8, que coincide con los valores de referencia no patológicos del KPTT, que es un FP3-time no autólogo.
Otros autores han medido la disponibilidad de PF3 en PRP ajustado a 200 x103/µl plaquetas, según la técnica de Hardisty RM et al. El rango normal se calculó con el PRP obtenido de 62 controles sanos tomados al azar de los donantes de un banco de sangre y fue de 33 ± 4 segundos. 14

El coeficiente de correlación lineal es un índice estadístico que mide la relación lineal entre dos variables cuantitativas. Los valores que se obtienen del mismo varían entre menos 1 y más 1. Cuando tal coeficiente es igual a cero las 2 variables x e y, son independientes entre sí. Cuando es igual a más 1 la correlación entre las variables es perfectamente directa, y cuando es igual a menos 1 es perfectamente inversa. El coeficiente de correlación lineal para nuestro método es de -0.936, es decir que las variables tienen una correlación cuasi lineal inversa, cuando la x sube la y disminuye, cuando la x baja la y aumenta. El coeficiente de regresión es la pendiente de la línea recta que relaciona más estrechamente dos variables correlacionadas. Indica el número de unidades en que se modifica la variable dependiente “Y” por efecto del cambio de la variable independiente “X” o viceversa en una unidad de medida. El coeficiente de regresión puede ser: Positivo, Negativo y Nulo. Es positivo cuando las variaciones de la variable independiente X son directamente proporcionales a las variaciones de la variable dependiente “Y” Es negativo, cuando las variaciones de la variable independiente “X” son inversamente proporcionales a las variaciones de Y. Es nulo cuando ninguna ley química física y matemática correlaciona ambas variables. El coeficiente de regresión en nuestra curva es de – 0.76, lo que significa que cuando la concentración de FP3 aumenta al doble, por ejemplo, la lectura del aparato en segundos baja 1.52 veces.

3- Precisión: Refleja la medida en que los valores de una serie repetida de ensayos analíticos que se realizan sobre una muestra homogénea son semejantes entre sí, y es una expresión de la reproducibilidad del método. Refleja, en definitiva, el error aleatorio.

Debe efectuarse sobre muestras homogéneas, es decir, sobre una misma muestra, pero de distintas concentraciones a los fines de evaluar si el método es preciso en todo el rango de medidas.
Se trabaja con una muestra de concentración baja, otra media y otra alta. Si el método se mantiene preciso a distintas dosis se concluye que la concentración de la muestra no influye en la determinación.
Generalmente se efectúa una evaluación intraensayo y otro interensayos, sobre un número de muestras n=10 en cada caso.

A medida que aumenta la concentración del analito se obtiene mayor DS y menor CV, esto es debido a que el coeficiente de variación es un cociente entre la desviación estándar y la media de las medidas, por lo que a mayores concentraciones y mayores valores de la media disminuye el CV.

La DS y el CV intraensayo es menor a la DS y el CV interensayos. En el primero, según hemos dicho, una misma muestra se procesa diez veces en la misma corrida, es decir, en similares condiciones del ensayo; en el segundo se procesan 10 alícuotas de una misma muestra en distintas corridas. En general se admite que DS arroje valores menores a 5.00 en la zona de concentraciones fisiológicas, y de 10 en zonas de concentraciones 3 o 4 veces superior, intraensayo: o DS de 10 y de 30, respectivamente, en la evaluación del comportamiento interensayos. El cumplimiento de tales parámetros validarían el ensayo.

En niveles fisiológicos de FP3 hemos obtenido los siguientes valores: 53.05; 49.09; 48.22; 47.33; 44.69; 44.26; 43.83; 39.87; 39.42 segundos; con una media de 45.36, una DS de 4.17, y un CV del 9%.
En niveles bajos del analito, correspondientes a diluciones 1:8 hemos obtenido los siguientes valores: 259.8 ; 322.9 ; 348.4 ; es decir con una media de 310.37, una DS de 45.61 y un CV del 15%, con una gran dispersión el método dejaría de ser preciso en esta zona de la curva dosis-respuesta. Esto era de esperar pues estaríamos en valores ocho veces inferiores a los fisiológicos, del orden del 12% de los mismos, mientras que la mayoría de los métodos se validan para concentraciones de entre 50 y 150% del valor fisiológico.

En la dilución 1:4, correspondiente al 25% del valor fisiológico hemos obtenido los siguientes valores: 165.4; 187.9; y 110.2; con una DS de 39.98 y un CV del 26%, también alto.

En la dilución 1:2, correspondiente al 50% de los valores fisiológicos la DS obtenida es de 1.54
En la dilución 1:3, correspondiente al 33.33% de los valores fisiológicos se obtiene una DS de 8.63 y un CV del 12%, que resulta inferior a la DS de 10 y de 30, requerido en las zonas patológicas, intraensayo e interensayo, respectivamente.

El método resultaría validado para concentraciones de alrededor de 1:3 de las fisiológicas, es decir, para valores de FP3-time de hasta 85.81 segundos, tal cual lo hemos obtenido al estudiar la linealidad.
El método es muy robusto si tenemos en cuenta que el 33.33% de los valores fisiológicos de los niveles de colesterol sérico, por ejemplo, rondarían los 66.66 mg/dl, que es un valor comparable con la fracción correspondiente al colesterol bueno o HDL. Las determinaciones de colesterol de la HDL efectuadas por el método enzimático convencional de colesterol total sobre el sobrenadante de una precipitación selectiva, requiere de 5 veces más muestra que el método original para ser lo necesariamente sensible y exacto. Mientras que el método coagulométrico de determinación de FP3 resulta validado en esos niveles sin alterar la cantidad de plasma empleada en la determinación.

La precisión en el punto correspondiente a 150% de la media normal se efectuó con el agregado de 30 microlitros de FP3 exógeno al sistema de 300 microlitros de PRP más 30 microlitros de caolín, y se obtuvieron los siguientes valores: 47.89 , 45.14 , 9.55, 3.85, 42.94 y 40.37, con algunos valores muy discordantes, con una media de 31.62

3- Exactitud: Indica la capacidad del método analítico para obtener resultados lo más próximo posibles al valor verdadero, y es una medida del error sistemático. Para asegurar una buena exactitud es necesario eliminar los errores referidos al funcionamiento y calibración de los equipos de lectura, los errores inherentes al blanco de reactivos, y los que dependen de la cantidad de analito presente.

La mejor manera de identificar los errores sistemáticos y la exactitud del método son los controles de calidad interlaboratoriales o en su defecto intralaboratoriales pero con referencia a otro método de calidad reconocida.

En el caso que nos ocupa, la calibración del autoanalizador se realiza de manera automática antes de cada corrida diaria.

En los métodos coagulométricos no existe blanco de reactivos, o existe un blanco interno para cada muestra. La exactitud o inexactitud de este método coagulométrico propuesto depende únicamente de la versatilidad con que el método resuelve la lectura de las distintas concentraciones del analito.

Los errores relativos a la cantidad de analito presente ya ha sido estudiada.

Conclusión:

El factor plaquetario 3 tiene un rol de suma importancia en el anclaje plaquetario al sitio de la lesión, y las patologías que cursan con disminución del factor plaquetario podrían tener episodios de sangrado espontáneo de las lesiones, y alteraciones en la coagulabilidad de la sangre a expensas de un alargamiento del sistema intrínseco de la coagulación. Sus valores están influenciados por la cantidad y calidad de las plaquetas, cantidad de plaquetas agregadas, cantidad de plaquetas activadas, calidad de la membrana plaquetaria. Alteraciones en la retracción del coágulo y en el tiempo de sangría se asocian con alteraciones de FP3. En aquellas situaciones que transcurren con un incremento de los monómeros de fibrina, como en el embarazo, la CID, y otras, sería de esperar una hiperagregación plaquetaria y alteraciones del valor de FP3. Disgammaglobulinemias, paraproteinemias, y patologías que cursan con anticuerpos contra plaquetas como PTI, dificultan la liberación de FP3 por engrosamiento y alteración de la membrana plaquetaria debido a los anticuerpos fijados u opsonizados en la misma. Los valores de FP3 aumentan en estados procoagulantes como en el embarazo y la microangiopatología diabética. El caolín, que activa la disposición de FP3, inactivaría en algún sentido la trombostenina plaquetaria ya que no se produce la retracción del coágulo en las muestras de PRP inducidas con caolín.

El rango de referencia para FP3 en muestras de pacientes normales es de 30 a 60 segundos.
El método desarrollado es específico puesto que el agregado de 25% de interferentes sin degradar, consistente en FP3 exógeno, produce valores esperados en la zona de la curva de calibración de concentraciones mayores del analito.

El método es lineal desde el 50 al 150 de los valores fisiológicos, cuasi lineal desde el 33.33% al 150% de los valores fisiológicos, y es preciso hasta 33.33% del normal; por lo tanto resultaría validado para concentraciones de alrededor de 1:3 de las fisiológicas, y valores de FP3-time de hasta 85.81 segundos, tal cual lo hemos obtenido al estudiar la linealidad del método.

El método es muy robusto puesto que requiere la misma cantidad de muestra para concentraciones tres veces inferiores, sin alterar su exactitud y sensibilidad.

El método es exacto pues no tiene errores referidos al funcionamiento y calibración de los equipos de lectura, ni errores inherentes al blanco de reactivos, ni errores dependientes de la concentración del analito.

Existen muchas entidades clínicas con alteraciones de la cantidad y calidad de las plaquetas, de la agregación y activación de las mismas, y de la disposición de factor plaquetario 3; y posiblemente surjan nuevos conocimientos de la fisiología plaquetaria a partir de la incorporación de la determinación de FP3, una prueba dinámica de su funcionalismo, en el coagulograma convencional.

Referencias bibliográficas:

1- El laboratorio en la Clínica, Ióvine-Selva, 1975, Editorial Médica Panameriana.
2- The Journal of Clinical Investigation, abril 1968, 47 (4): 901-912.
3- Weber A.J., Jonson S.A.: Platelet participación in blood coagulation aspects of hemostasis Am J Pathol 60:19, 1970-Revista Cubana de Inmunologia y Hemoterapia, Alteraciones de la hemostasia en la diabetes mellitas, Lic. Patricia Almagro; 2005.21
4- Cirugía: fundamentos, indicaciones y opciones técnicas, Volumen 1-119, Cristóbal Pera Blanco Morales.Ed. Elsevier-Masson, 2da ed. España, 1996.
5- Caen J P, Sultan y Delobel J: Les Trombopathies Acquises Noulv. Rev. Franc. Haematol. 9,553, 1969
6- Hematología: medicina de laboratorio-pag 906, J. Miale, Ed. 1, Reverté S.A. http://www. reverte.com/ ISBN 9788429 155501.
7- Álvarez Amaya, Carlos; Dorantes, Samuel; Toro, Abel H; Bello, Abel; Cuellar, Jesús. Forma atenuada del síndrome de Wiskott Aldrich y la trascendencia de su identificación en el pronóstico de la esplenectomía / Attenuated form of the Wiskott Aldrich syndrome and the transcendence of its identification in splenectomy prognosis. Bol. méd. Hosp. Infant. Méx;54(11):566-76, nov. 1997. tab, ilus
8- Levy-Toledano S, Dmozynska A, Dupuy E. Platelet coaglation activies in diabet patients. En: Regnault F. Duhault J, eds. Cellular and biochemical aspects in diabetic retinophaty. New Cork: Elsevier-North Holland Biomedical Press, 1978. p 69-88
9- http://www. cirugest.com /htm/revisiones /cir01-04/01-04-01.htm
10- Hematología Clínica, J. Sans Sabrafen, C Besses Raebel, JL Vives Corrons, Ed. Elservier, 5ta ed. 2009, http//www.elservier.es
11- Calpena AC, Escribano E, Fernandez C. Validación de los métodos analíticos. Farm Clin 1991; 7(9): 749-58, citado por Revista Cubana de Farmacia versión impresa ISSN 0034-7515, v30 n1, Ciudad de la Habana enero-abril 1996.
12- United Status Pharmacopeial Convertion USP XXII: United Status Pharmacopeial. 22ed. Easton:Mack Printing, 1990:1225,1710; citado por Revista Cubana de Farmacia versión impresa ISSN 0034-7515, v30 n1, Ciudad de la Habana enero-abril 1996.
13- Rampazoo P. Standardisation and validation of analytycal methods in the pharmaceutical industry. II Fármaco 1990;45:807-15; citado por Revista Cubana de Farmacia versión impresa ISSN 0034-7515, v30 n1, Ciudad de la Habana enero-abril 1996.
14- ESTELA H. KRAMER 1, BEATRIZ SASSETTI 2 ALFREDO J. KAMINKER 1, ANTONIO R. DE LOS SANTOS 3, MANUEL L. MARTÍ 3, GUILLERMO DI GIROLAMO 4- ACCIÓN DEL CLONIXINATO DE LISINA SOBRE LA FUNCIÓN PLAQUETARIA COMPARACIÓN CON OTRAS DROGAS ANTIINFLAMATORIAS NO ESTEROIDEAS-MEDICINA (Buenos Aires) 2000; 60: 301-307.
15- Bakhtawar K. Mahmoodi y col., del Centro Médico de la Universidad de Groningen, Países Bajos