Las radiaciones ionizantes pueden causar daño molecular y celular por vía directa o indirecta. Un impacto directo sobre una molécula de DNA puede causar la rotura de una unión interatómica que no se repara antes de la división celular. Debido a que gran parte de la célula está formada por agua, este tipo de daño directo no es tan probable como el daño indirecto, que ocurre por la ionización del agua y la subsiguiente producción química de radicales libres altamente reactivos.
Modelo de estudio del choque directo radioactivo independiente del efecto peróxido, en la citoexposición, con el propósito de demostrar que es un fenómeno eminentemente nuclear.
Dr. José Luis Bracco, Bioquímico, Jefe de laboratorio GNLAB. General Galarza 1082/86, Concepción del Uruguay, Provincia de Entre Ríos, República Argentina.
Resumen
Las radiaciones ionizantes pueden causar daño molecular y celular por vía directa o indirecta. Un impacto directo sobre una molécula de DNA puede causar la rotura de una unión interatómica que no se repara antes de la división celular. Debido a que gran parte de la célula está formada por agua, este tipo de daño directo no es tan probable como el daño indirecto, que ocurre por la ionización del agua y la subsiguiente producción química de radicales libres altamente reactivos.
Debido a la propiedad de las enzimas celulares, catalasas y peroxidasas, de minimizar el efecto peróxido producido por las radiaciones; es que un tejido celular integrado por células ricas y células carentes de tales enzimas, como el tejido sanguíneo, resultaría óptimo para estudiar modelos puros de choque directo, de efecto peróxido, y de acción radiobioclástica total.
Se expusieron muestras de sangre entera edetatada a la acción radiactiva, y se fotografiaron las imágenes microscópicas obtenidas; de manera de observar los cambios morfológicos producidos por la radiación y elaborar una teoría de la citopatología de la exposición.
Al trabajar con muestras normales y leucémicas se observó y se documentó microfotográficamente, que el choque directo radioactivo induce fenómenos de alteración de la maduración nuclear.
Summary
Ionizing radiation can cause molecular and cellular damage by direct or indirect. A direct hit on a DNA molecule can cause breakage of interatomic bond which is not repaired before cell division. Because much of the cell consists of water, this type of direct damage is not as likely as indirect damage that occurs by ionization of water chemistry and the subsequent production of highly reactive free radicals.
Because ownership of cellular enzymes, catalase and / or cellular peroxidases, peroxide minimize the effects produced by radiation, is composed of cellular tissue rich cells and cells lacking these enzymes, such as blood tissue, it would be optimal for studying pure shock models direct, peroxide effect, and total radiobioclástica action.
Blood samples were exposed to the action edetate entire radioactive, and were photographed microscopic images obtained, in order to observe the morphological changes produced by radiation and to develop a theory of cytopathology of exposure.
Working with normal an d leukemic samples was observed and documented microphotographic, which induces direct impingement radioactive phenomena of altered nuclear maturation.
Diccionario - PALABRAS CLAVE: Radiaciones ionizantes, Choque directo y efecto peróxido, Peroxidasas, Neutrófilos, Radioiodo, Microfotografía.
KEYWORD: Ionizing radiation, Direct shock and peroxide effect, Peroxidases, Neutrophils, Radioiodine, Photomicrograph.
Introducción:
La radioactividad es una desintegración espontánea del núcleo de ciertos cuerpos simples, denominados radioactivos, que origina otro elemento de número atómico mayor o menor, y es acompañada de emisión de radiaciones. Determinadas emisiones radioactivas se caracterizan por ionizar el aire y otros gases haciéndolos conductores de la electricidad, por provocar acciones químicas como la descomposición del ácido nítrico, por excitar la fluorescencia en ciertos compuestos como el sulfuro de zinc, por provocar en un organismo vivo determinadas acciones fisiológicas, etc. (1)
Las radiaciones pueden ser no ionizantes, como la luz ultravioleta, visible, infrarroja, y ondas de radio, compuestas por fotones que no poseen la suficiente energía para ionizar átomos; o pueden ser ionizantes como los rayos X y gamma, que son radiaciones electromagnéticas, y los electrones de alta velocidad, núcleos de helio, protones y neutrones, que son partículas. (1)
Los rayos X y gamma son radiaciones electromagnéticas de longitudes de onda corta. Los rayos X se producen por la rápida aceleración o desaceleración de partículas cargadas y por transición entre cubiertas electrónicas de átomos u orbitales. La radiación gamma se produce por degradación radioactiva de átomos. (1) Ambas radiaciones son ionizantes.
La ionización puede causar daño molecular y celular por vía directa o indirecta. Un impacto directo sobre una molécula de DNA puede causar la rotura de una unión interatómica que no se repara antes de la división celular. Debido a que gran parte de la célula está formada por agua, este tipo de daño directo no es tan probable como el daño indirecto, que ocurre por la ionización del agua y la subsiguiente producción química de radicales libres altamente reactivos. (1)(2)(3)(4)
Algunos autores opinan que son los radicales libres los que ocasionan el daño y no la radiación ionizante. (1) Sin embargo, observaremos más adelante que algunas oxidorreductasas celulares son enzimas encargadas de disminuir o neutralizar los radicales libres, provengan del propio metabolismo celular o de la acción de radiaciones, mientras que el impacto directo no puede ser minimizado por procesos biológicos.
Según la teoría del blanco, del impacto, o del choque directo, las radiaciones al chocar contra las moléculas blanco intracelulares, ionizan distintas sustancias más o menos vitales, produciendo una lesión reversible o irreversible en la célula. Tal ionización puede provocarse con un solo golpe o con dos o más golpes; ocurriendo en el primero de los casos mutaciones intragénicas y por lo tanto submicroscópicas, metabólicas, o microscópicas indirectas a través de los cambios metabólicos inducidos por la mutación; y en el segundo, mutaciones o delecciones cromosómicas, microscópicas y por lo tanto evaluables con el microscopio óptico y la microfotografía. (1)(3)(4)
Con la acción de pequeñas dosis de radiación todas las mutaciones resultan puntuales, de un solo golpe, intragénicas. Con dosis mayores aparecen aberraciones de doble golpe, cromosómicas, generalmente en forma de delecciones. (1)(3)(4)
La vieja concepción, basada en la aplicación de la teoría del blanco, consideraba que la mutación surgía de inmediato a raíz del efecto del impacto. Ahora sabemos que las mutaciones transcurren como transformaciones químicas complejas, en el cromosoma, para cuya realización se requiere un cierto tiempo. (1)(3)(4)
Según la teoría de la acción indirecta, la energía radiante al actuar sobre el agua, principal constituyente celular, produce radicales libres del tipo peróxido que al ser muy inestables y actuar sobre otros blancos específicos provocan daño en tales moléculas celulares, que se traducen en lesión celular. Los radicales libres surgidos del efecto peróxido pueden atacar el DNA nuclear en los mismos sitios y de similar manera que el impacto radioactivo del choque directo. (1)(3)(4)
La mejor comprobación de la teoría del blanco consiste en el hecho de que las curvas teóricas calculadas para la relación entre la dosis de partículas ionizantes y cantidad de efecto, suelen ajustarse con las curvas prácticas encontradas. Estas curvas son exponenciales y en su origen se aproximan a una recta, por lo que para dosis pequeñas la relación entre las dosis y las rupturas, es lineal. (3)(4) Esto significaría que, a dosis bajas, el choque directo radioactivo podría llegar a actuar como único evento radiocitológico, pero esto dependería de las defensas antioxidantes celulares, sobre todo de las enzimas del tipo de las peroxidasas.
Como las dosis bajas de radiación generalmente no alcanzan para matar a las células, pero inducen alteraciones estocásticas en el genoma que serán trasmitidas a las generaciones celulares venideras, el estudio del choque directo radioactivo proporciona un modelo interesante de daños biológicos asociados con la teratogenia y la carcinogénesis.
La teoría de la acción indirecta o del efecto peróxido, por otra parte, se constata en un fenómeno interesante de fotosensibilización. (5)
En los microorganismos se comprueba fehacientemente el efecto peróxido inducido por las radiaciones, en la llamada sensibilización fotodinámica. Generalmente la luz visible ejerce escasos efectos biológicos sobre las células que no poseen clorofila u otras sustancias coloreadas que aumenten de forma significativa la absorción de la luz. En los microorganismos que poseen pigmentos coloreados la luz produce lesiones biológicas, las que son inhibidas en presencia de catalasa, aún a dosis relativamente grandes de radiación. (5)
La catalasa es una enzima del tipo de las oxidorreductasas, que descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno molecular. Su efecto catalítico es uno de los más rápidos de entre todas las enzimas conocidas, y actúa protegiendo a los constituyentes celulares del peróxido de hidrógeno formado por las múltiples reacciones oxidativas. (1)
La catalasa se halla presente en casi todos los sistemas celulares, con excepción de ciertas bacterias como la mayoría de los anaerobios obligados y las bacterias productoras de ácido láctico; y está por lo tanto asociada a la respiración celular oxidativa. La peroxidasa, cuando descompone peróxidos deja oxígeno atómico en libertad que necesariamente debe ir a oxidar a sustratos donantes de electrones; se comporta, entonces como oxidante, y también sirven para remover los peróxidos tóxicos celulares.
Desde el punto de vista biológico las acciones de catalasa y peroxidasa son similares, y debe considerarse a la catalasa como una peroxidasa que libera oxígeno molecular en lugar de oxígeno atómico. (6)
Debido a la propiedad de la peroxidasa de minimizar el efecto peróxido producido por las radiaciones, es que un tejido celular integrado por células ricas y células carentes de peroxidasas, como el tejido sanguíneo, resultaría óptimo para estudiar modelos puros de choque directo, de efecto peróxido, y de acción radiobioclástica total.
El modelo de estudio del choque directo se efectúa evaluando el comportamiento de células ricas en peroxidasas que eliminan el efecto peróxido inducido por la radiación, como los leucocitos polimorfonucleares neutrófilos (LPMNn). El modelo de efecto peróxido puro no se puede conseguir de no ser un modelo de efecto peróxido maximizado que minimice o desprecie el choque directo, pues éste no se puede eliminar ni disminuir de un modo absoluto para cualquier dosis de radiación.
Antecedentes:
1- La introducción del uso de radioisótopos en los estudios bioquímicos celulares fue de una importancia incalculable para la bioquímica y la biología molecular. Generalmente se los empleó como marcadores de biomoléculas de modo que sus destinos metabólicos pudieran vigilarse de modo conveniente, por técnicas autorradiográficas. A partir de ellos se dedujo que el metabolismo celular es un proceso muy activo, en donde la mayor parte de los compuestos se están sintetizando y degradando en forma continua, aunque a velocidades que difieren ampliamente. Gracias a su empleo se conocieron varios aspectos del metabolismo de las proteínas, carbohidratos y lípidos. Se desarrollaron estudios embriológicos en donde se evaluó el papel de los puffs cromosómicos en la diferenciación celular. Se conoció la dinámica núcleo citoplasmática del RNA mensajero. La investigación de las biomoléculas simples y complejas, in vivo o in vitro, se basa ampliamente en su uso. El gran avance logrado en la secuenciación de los ácidos nucleicos y en la medición de cantidades extremadamente pequeñas de compuestos que se encuentran en los sistemas biológicos, se debe a una rama de la radiobiología aplicada a ensayos cuantitativos, el radioinmunoanálisis. (7)
Los isótopos radioactivos más empleados en estudios radiobioquímicos y de biología molecular, son el tritio, carbono 14, fósforo 32, azufre 35, calcio 35, iodo 125 y el iodo 131. (7)
2- Las técnicas empleadas para estudiar los procesos bioquímicos, que utiliza actualmente la bioquímica y la biología molecular, son: estudios a nivel del animal íntegro, órgano aislado perfundido, cortes de tejidos, células intactas, homogeneizado de órganos o tejidos, organelos celulares aislados, subfraccionamiento de organelos, aislamiento y caracterización de metabolitos y enzimas, clonación de genes que codifican enzimas y proteínas. El método que emplea células intactas es aplicable, fundamentalmente, a las células sanguíneas, ya que pertenecen a un tejido de fácil acceso, y pueden ser purificadas con relativa facilidad. Aunque en muchas áreas de la biología es indispensable el empleo de cultivos de tejidos. (7)
Nosotros emplearemos el Iodo 125 para estudiar la morfogénesis celular inducida en la citoexposición radioactiva, por el método de células intactas y de cultivo de tejido sanguíneo; pues ninguna característica está más unida a la fisiología, al metabolismo y a la fisiopatología celular, que los fenómenos plásticos (morfológicos). (9)
3- Otros autores han informado que la dosis más pequeña capaz de producir un aumento de las mitosis anormales, cuando se aplican dosis terapéuticas de 131 Iodo, era de 10 mCi. La frecuencia más alta de aberraciones ocurría entre las 3 y 13 horas posteriores a la administración y coincidían con la concentración máxima de radioiodo en sangre (11). Los 10 mCi de iodo radioactivo se distribuyen en sangre corporal a razón de 0.2 µCi cada 100 µl de sangre entera. En un trazador de radioinmunoanálisis, con una actividad de 10 µci en 5.0 ml, tal cantidad estaría representada por 100 µl de trazador. Basándonos en las consideraciones anteriores se adicionó 100 µl de trazador de 125 Iodo con un conteo de 120.000 c.p.m. a idéntica cantidad de sangre entera edetatada y se cultivó, habiéndose respetado las proporciones de modo que la población celular se mantenga en sus cantidades originales respecto a la sangre entera; en medio autólogo mínimo, a los fines de malposicionar a los mecanismos reparacionales de la lesión. Como blanco se empleó el cultivo de la misma muestra en idénticas condiciones, sin irradiar.
4- Las peroxidasas, enzimas de la clase de las oxidorreductasas, actúan sobre un sustrato donante de electrones con peróxido de hidrogeno como aceptor de electrones. Sirven para remover los peróxidos tóxicos dentro de la célula. Ejemplos de peroxidasa son la glutatión-reductasa y la catalasa. Estas enzimas, en los neutrófilos y otras células sanguíneas fagocíticas, podrían tener relación con el mecanismo de la fagocitosis.
De hecho los peróxidos, de gran acción bactericida, tienen relación con el metabolismo celular puesto en juego en la fagocitosis, y es conocida la alta concentración de los mismos en la zona de inflamación, causante entre otras cosas de la poca actividad anti inflamatoria de algunas drogas tipo aspirina, como el acetaminofeno, incapaz de bloquear la enzima ciclooxigenasa del metabolismo de las prostaglandinas en medios ricos en peróxidos.
El grupo de los elementos figurados de la sangre ricos en peroxidasa incluye a los hematíes, especies neutrófila, eosinófila, basófila y monocitaria. Toda la serie plaquetaria, los megacariocitos de la médula ósea y los tricoleucocitos son también peroxidasas positivos. Los linfocitos, por el contrario, son peroxidasas negativos. (6)
La mieloperoxidasa o peroxidasa granulocítica incluye en realidad dos enzimas perfectamente diferenciables: la peroxidasa neutrófila presente en los basófilos, neutrófilos y monocitos, y la peroxidasa eosinófila privativa de los así llamados granulocitos. Ambas pueden conservarse durante años sin inactivarse, en preparados secos guardados en lugar protegido. La luz y la temperatura las afectan poco. (6)
La peroxidasa neutrófila es capaz de soportar hasta 80-90 grados centígrados sin inactivarse y es sensible al cianuro de potasio. La eosinófila es resistente al cianuro de potasio. Ambas son inactivadas rápidamente por el metanol. (6)
El cianuro de potasio no puede usarse como modelo puro de inhibición de peroxidasas neutrófilas, porque el cianuro reacciona con el hierro trivalente de la citocromooxidasa bloqueando la fosforilación oxidativa de la respiración celular, y produciendo acidosis láctica desde la glucólisis anaerobia; con los cambios morfológicos y estructurales que esto conlleva.
El metanol inhibe las peroxidasas neutrófilas y eosinófilas y similar efecto presentaría el etanol; aunque es probable que ambos también actúen como scavenger o atrapadores de radicales libres, a través de sus propiedades reductoras. En experiencias de inducción con un reconocido scavenger como el etanol hemos observado que este alcohol también inactivaría las peroxidasas amplificando las lesiones por efecto de los peróxidos del mismo metabolismo celular. Según hemos observado en otras experiencias con inductores radioactivos, la diferencia entre el efecto scavenger del etanol y el efecto antiperoxidásico, depende de los tenores de peroxidasa y de peróxidos en los distintos tiempos de la experiencia de inducción. En LPMNn el efecto protector del etanol se vería disminuido, respecto a otras células carentes de catalasa, puesto que si bien atraparía radicales libres nocivos para las células, disminuiría las peroxidasas celulares con su acción antiperoxidásica. El etanol es, pues, un buen protector de sistemas celulares peroxidasa negativos.
Por otro lado hemos observado en algunos trabajos prácticos radiobiológicos, que el metanol (reconocido antiperoxidásico), cuando es empleado en una concentración del 35%, inhibe las peroxidasas permitiendo que se produzcan modificaciones y lesiones celulares de mayor magnitud y de igual índole que el choque directo, y que es la sumatoria de los dos efectos radiobiológicos.
El metanol produce efectos secundarios específicos en algunas células sanguíneas, fundamentalmente a nivel nuclear con metilación del DNA, que hemos denominado efecto metanol, y que provoca astillamiento del núcleo con patente de núcleo “en tenedor o tridente”.
5- El estudio de las distintas radiosensibilidades de los elementos sanguíneos se vio favorecido con la metodología de irradiación de hemoderivados con vistas a su transfusión en pacientes inmunodeprimidos. Aunque era ya conocido, a través de la observación de muestras sanguíneas de pacientes irradiados terapéuticamente, que los linfocitos, que son casi todo núcleo, son los leucocitos más radiosensibles. Las plaquetas, que son todo citoplasma, tienen una radiosensibilidad cinco veces menor. Los eritrocitos humanos, que son anucleados, muestran una vida media normal después de ser expuestos a dosis de 10 a 15 veces mayores que las dosis que inhiben la capacidad mitótica y la transformación blástica linfocitaria. En cuanto a los granulocitos, disminuyen la quimiotaxia y la bactericida pero a dosis más elevadas, teniendo una radiosensibilidad mayor que las plaquetas y menor que los linfocitos, y una curva de desaparición de sangre periférica, en la radioterapia, similar a la plaquetaria. (4) (11)
Como cada especie de leucocito podría actuar, por cuestiones intrínsecas, de modo distinto frente a una cierta dosis de exposición radioactiva, es mejor trabajar sobre los elementos maduros e inmaduros de una serie celular. Existen razones estadísticas para trabajar con las poblaciones con más densidad demográfica dentro de un especimen muestral. Los hematíes, muy abundantes, quedan excluidos debido a la gran radiorresistencia que le otorga la anucleación en los animales mamíferos. Sin embargo, muchas experiencias interesantes se podrían efectuar con hematíes nucleados de pollo, aunque resulta menos accesible su obtención. Las plaquetas, que le siguen en cantidad, constituyen un elemento figurado muy interesante para estudiar en trabajos de inducción radioactiva o no radioactiva, sobre todo sus formas celulares activadas de gran tamaño respecto a las normales, pero todavía pequeñas para una observación morfológica detallada. En ellas interesa únicamente saber si un determinado modelo indujo su activación, y compararla con la activación de células de la serie de los granulocitos neutrófilos, con quienes comparten similitudes metabólicas y estructurales (7) que estudiaremos en otra oportunidad porque resultan de gran importancia.
Las macroplaquetas, cuando se observan en frotis sanguíneos sin inducir, son consideradas por diversos autores como formas jóvenes que representan una producción acelerada de las mismas. De la serie blanca se descarta a basófilos, eosinófilos y monocitos, por su baja incidencia poblacional; los linfocitos merecen un tratamiento aparte, aunque adelantamos que las distintas subpoblaciones que lo integran, la ausencia de peroxidasa, el estrecho citoplasma, el índice mitótico distinto de las subpoblaciones, coadyuvan para descartarlo como modelo radiobiológico de elección en el caso que nos ocupa.
Fundamentación de la elección de LPMNn como célula diana:
1- Los leucocitos polimorfonucleares neutrófilos (LPMNn) son relativamente abundantes aún en muestras de sangre correspondientes a pacientes normales; no es dificil de encontrar especímenes leucocitósicos, leucemoides o leucémicos, con elementos de la progenie en distintos estadios de maduración.
2- Los LPMNn son ricos en peroxidasas y otras oxidorreductasas.
3- Los LPMNn reconocen como inductores a muchos xenobióticos, y entre ellos a muchos radiomiméticos, lo cual resulta muy útil para elaborar patentes de referencia de daño celular por agentes que actúan de igual manera que los radionucleidos.
4- Los LPMNn tienen abundante núcleo y citoplasma.
5- Los LPMNn son fagocíticos y por lo tanto fáciles hospedadores de DNA exógeno.
6- Los LPMNn son metabólicamente muy activos y ofrecen un amplio espectro de alteraciones estructurales o funcionales a considerar en distintos sistemas de inducción: la opsonización nos puede proporcionar datos estructurales y metabólicos de la membrana citoplasmática. La quimiotaxia y endocitosis, del citoesqueleto.
Nótese una conidia fúngica opsonizada y algo engolfada en la membrana citoplasmática de un leucocito polimorfonuclear neutrófilo. En la generalidad de los casos la misma ocurre de manera perpendicular a la membrana del leucocito en un fenómeno en el que están involucrados los potenciales de membrana.
Nótese la entrada de la conidia en forma perpendicular a la superficie del neutrófilo inferior, el contacto de la misma con el núcleo, también observable en la próxima microfotografía, y la gran vacuolización del citoplasma.
La fagocitosis y la bactericida nos brinda datos del estallido respiratorio, del metabolismo, y de la peroxidación de lípidos de membrana por las especies reactivas del oxígeno.
Fagocitosis de una célula levaduriforme por un leucocito polimorfonuclear neutrófilo. Nótese:
a) el cambio de color de la levadura, de azul la no fagocitada a verde claro la fagocitada, por oxidación de los lípidos de la pared del hongo y por oxidación del colorante, debido a los RLO del estallido respiratorio de la fagocitosis.
b) la micropolivacuolización citoplasmática producida por la peroxidación de lípidos de las membranas celulares; y la involución del núcleo polilobular inducida también por tales metabolitos de la especialización.
El citoplasma amplio, delgado y sin granulaciones groseras permite el estudio de las organelas, el retículo endoplásmico, el Golgi, las mitocondrias, cuando se elige convenientemente el modelo de inducción empleado.
Muestra de sangre normal inducida por un xenobiótico. Nótese la presencia de un leucocito polimorfonuclear neutrófilo trilobular con organelas hipertrofiadas en su interior, de disposición paralela, que podrían corresponder a mitocondrias.
Materiales y métodos
Materiales:
1- EDTA
2- Trazador de 125 Iodo
3- Colorante hematológico Giemsa
4- Microscopio UV VIS Alphaphot, YSH, Nikon.
5- Cámara fotográfica reflex Zenit TTL con película de 35 mm, de 100-120 ASA, grano normal.
6- Adaptador microfotográfico transocular marca Pentax c/alargadores de teflón fabricados por nosotros.
7- Pulsador con traba, para fotografías con tiempo amentado de exposición.
Fundamentación de las condiciones de cultivo:
En las experiencias de inducción elaboradas por nosotros el tema clave a considerar era doble, por un lado la conservación de la muestra en términos metabólicos lo menos alejado posible del metabolismo in vivo, por otro lado la conservación de la muestra en términos de viabilidad. Si disminuíamos la temperatura de incubación de modo de incrementar la viabilidad deprimíamos demasiado el metabolismo celular y la morfogénesis inducida. Por lo tanto optamos por una temperatura intermedia, de alrededor de 30 ºC, de modo que la ralentización de los procesos metabólicos permita a las células incrementar en parte su viabilidad disminuida. (8) En estas condiciones de incubación, y basándonos en algunas consideraciones especulativas de la teoría hematológica que seguidamente detallaremos, logramos el seguimiento de la viabilidad durante dos semanas en medio autólogo mínimo adicionado de algunos agentes de inducción, sin la necesidad de aporte externo de oxígeno.
Los basamentos teóricos fueron los siguientes:
1- Los fagocitos tisulares y sanguíneos corresponden a un mismo tipo celular adaptado a sus respectivos nichos ecológicos.
2- Los fagocitos tisulares desarrollan un metabolismo aerobio o anaerobio en dependencia de las tensiones de oxígeno de los nichos ecológicos, teniendo una respiración aerobia los fagocitos pulmonares y un metabolismo anaerobio los fagocitos intestinales.
3- El aspecto macroscópico de las muestras hematológicas cultivadas en medio mínimo, conservadas por 72 horas a temperatura ambiente denotan una viabilidad conservada de la oxihemoglobina.
4- No se observan células falciformes en las muestras cultivadas, por 72 y más horas. Esto significa que en el interior del container de cultivo cerrado, se conserva una determinada y suficiente tensión de oxígeno.
En muestras de sangre edetatada sin inducir ni irradiar, cultivadas en medio mínimo a 30oC 48 horas, se observa un neutrófilo de adaptación, con las siguientes características morfológicas:
a) perdió los filamentos interlobulillares,
b) los lóbulos se volvieron cariopicnóticos.
c) Se observa una única microvacuola, lo cual indica escasas alteraciones de membrana, depresión del metabolismo celular, y/o eficiencia mantenida de las peroxidasas celulares. No se observan hematíes falciformes.
Muestra: Sangre entera edetatada normal y leucémica.
Método: Inducción en medio autólogo mínimo a 30 ºC
Siembra: 100µl de trazador +100µl de sangre edetatada
Revelado: Se efectuaron extendidos a las 4, 24 y 56 horas, tincionándose con M.G.G. y microfotografiándose las imágenes microscópicas obtenidas con máquina fotográfica Reflex Zenit TTL (URSS), adaptador pentax transocular, microscopio Nikon YSH. Las películas utilizadas fueron Kodak color de 35 mm, 100 asa, grano normal, y el tiempo de exposición osciló entre 15 y 30 segundos.
Resultado:
En fotos correspondientes a extendidos radioinducidos de sangre normal efectuados a las 4 horas de exposición se observan neutrófilos con pseudoaspecto de metamielocito neutrófilos en transición a band cell N, como si hubiera ocurrido una involución de LPMNn hacia células de su progenie.
Se observa unilobulación con presencia, en algunos, de ventana de Owren-Oswald. Ocurre aumento del volumen celular o tumefacción, con aspecto amorfo de la estructura nuclear eucromatínica y presencia de acúmulos de heterocromatina. Se observa discreto engrosamiento de la membrana nuclear y moderado de la citoplasmática. Escasa afectación de los organitos con escasa manchas citoplasmáticas atípicas. No se observan patentes de daño de membranas como la vacuolización nuclear o la citoplasmática, ni alteraciones del ergastoplasma y de las mitocondrias.
Paraforma de neutrófilo con pseudoinmaduración inducida por la radiación: núcleo en ojo de pájaro.
Suelen aparecer blastos de estructura similar y núcleo en "ojo de pájaro" en leucemia mieloide crónica (LMC) en tratamiento con antileucémicos, aunque también hemos observado en no tan raros casos, inmunocitos con ventanas de Owren-Oswald en pacientes aparentemente normales.
Paraforma de neutrófilo inducida por la radiación, con ventanas de Owren-Oswald
Los LPMNn polilobulares o polilobocitos, que son más viejos, alteran menos la morfología de sus núcleos cuando se exponen a la radiación, observándose la persistencia de, al menos, un filamento interlobulillar. Esta observación experimental resulta de sumo interés para la radiobiología, y será retomada luego, cuando tratemos la relación entre la radiosensibilidad y la heterocromatinización. No se observa en estas entidades más viejas tumefacción nuclear ni citoplasmática, limitándose los cambios nucleares a una ligera agrumación de cromatina, como ocurre en las lesiones leves, hacia los bordes de los lóbulos.
Se observa la presencia de un polilobocito, hematíes y algunas plaquetas, correspondiente a una muestra de sangre normal irradiada. Nótese la agrumación de la cromatina hacia los bordes de los lóbulos.
La descripción anterior nos sugiere que las primeras alteraciones inducidas por la radioactividad (en los leucocitos polimorfonucleares, ricos en peroxidasa y por lo tanto con efecto peróxido reducido o ausente), serían de índole nuclear, con redistribución de la cromatina y sin vacuolizaciones. La ausencia de vacuolización nos estaría indicando la ausencia o minimización del efecto peróxido por salvaguarda de las peroxidasas neutrófilas. Los radicales aniónicos (O2-) pueden transformarse en oxígeno simple por un mecanismo no enzimático y atacar, al igual que otros radicales libres, los lípidos poliinsaturados de las membranas celulares dando lugar a la formación de hidroperóxidos lipídicos. Estos son inestables en presencia de vestigios de iones metálicos de transición y se descomponen en radicales libres de lípidos. Las vacuolas celulares son buenos marcadores de daños de membrana producidos, sobre todo, por los radicales libres, provengan o no del oxígeno, y cuyo efecto se propaga en la peroxidación de lípidos.
Posterior a la redistribución cromatínica se produciría una desaparición de los filamentos interlobulillares, muy densos en cromatina para sus pequeñas dimensiones, y por lo tanto más radiosensibles que el resto de la estructura nuclear; y una tendencia a la Pelgerización Stodmeisteriana. Es útil recordar que la anomalía de Pelger-Huet o falta de segmentación de los neutrófilos con condensación grosera de su cromatina es una entidad de etiología genética que se transmite con carácter autosómico dominante. La cromatina de los núcleos de Pelger-Huet se caracteriza por su concentración grosera formando masas que han determinado su designación de núcleo en escarapela. Tales leucocitos, no obstante, conservan intacto su funcionalismo, estando disminuida la proporción de palillos de tambor en los casos femeninos debido a la compactación de la cromatina. (6)
Al parecer tal compactación no produciría inhibición de los genes bajo cuyo control se sintetizan las enzimas de diferenciación y especialización.
El corpúsculo de Barr observable en el núcleo de las células femeninas en interfase, al igual que los palillos de tambor o drumstick observables en el núcleo de los LPMNn, son el mejor ejemplo de heterocromatina y corresponden a un cromosoma X inactivado. Este cromosoma, debido a la mayor espirilización, replica más tardíamente y permanece condensado más tiempo que el otro cromosoma X ; lo cual explica su aparición de modo visible durante la interfase. En los núcleos de Pelger-Huet, como está condensada toda la cromatina, enmascara al cromosoma X condensado que se torna en no visible en la interfase.
Los cromosomas sexuales tienden a estar entre los últimos cromosomas que alcanzan los polos del huso mitótico durante el movimiento anafásico. Ocasionalmente, uno puede rezagarse tanto en relación con los otros que la lámina celular se cierre entre ambos polos antes de que el cromosoma sexual pueda llegar a su destino. El resultado es que un cromosoma puede ser incluido en la otra célula o ser excluido de ambas, dando lugar a una aneuploidía, o a cromosomas aislados, respectivamente, (6) y positivando el ensayo del micronúcleo tan empleado para evaluar la inestabilidad genética por exposición a genotóxicos.
Otra entidad de etiología genética en la que es frecuentes la disminución del número de lóbulos de los LPMN es el síndrome del maullido de gato, que es el más característico de las cromosomopatías del grupo B, y en la cual se encuentra una delección parcial de los brazos cortos del par cromosómico número 5, que es el más pequeño y el que replica más precozmente. También se han descripto cromosomas 5 en anillo en el síndrome en cuestión. (6)
En el síndrome de Down ocurre un aumento de la fosfohexoquinasa que sugiere que el locus del gen responsable de esta enzima guarda relación con el cromosoma 21, una disminución en la vía metabólica de la serotonina y una inhibición de la maduración de los polimorfonucleares, con disminución del número de lóbulos y de la frecuencia de drumstiks en las hembras. (6)
Estudios experimentales en animales y en cultivos in vitro de material humano, efectuado por otros autores, demuestran que las radiaciones (ionizantes, no ionizantes, gamma, neutrones), son capaces de lesionar la célula y producir alteraciones cromosómicas. Las observaciones clínicas de pacientes irradiados accidentalmente, terapéuticamente o con fines diagnósticos, mostraron que las lesiones cromosómicas más frecuentes ocasionadas consistían en cromosomas dicéntricos, anulares, y algunas delecciones que dan lugar a cromosomas similares al Ph. (10)
Tales autores consideran que es imposible determinar con exactitud la intensidad o la dosis de radiación para producir una lesión cromosómica en la especie humana, ya que las lesiones constatadas son una mínima parte de las producidas, pues traducen sólo las de las células supervivientes a la lesión. (10) De todas formas, la radiactividad abre primero en la membrana citoplasmática y estructuras vecinas, cilindros de ionización, y posteriormente en la nuclear. Pero como los cromosomas estarían todavía intactos se pondrían en juego mecanismos reparacionales de la lesión. Tales mecanismos dejarían de funcionar con la lesión de los genes o de los cromosomas responsables de tal proceso de reparación. Por eso, tal vez, en la acción biológica de la radiactividad por efecto del choque directo independiente del efecto peróxido, los cambios atípicos tienen mayor lugar en el núcleo, y se ven poco las formas de vacuolización por degeneración hidrópica. Es interesante recordar que para que ocurra la reparación de membranas no solo deberá estar intacto el mecanismo citoplasmático y/o nuclear que gatilla la orden al núcleo de la codificación de la enzima reparadora, sino todo el mecanismo de la síntesis proteica, y que éste, al parecer, sería viable aun cultivando las células en medio mínimo y a 30ºC. Esta viabilidad la hemos comprobado no solo en experiencias de fagocitosis lenta, que es un excelente certificado de integridad de los sistemas metabólicos y por ende de viabilidad de la célula, sino siguiendo la evolución celular durante una semana, en sangre en medio autólogo mínimo, pero adicionado de cobre, peróxido de hidrogeno, oxidasa de la glucosa y peroxidasa.
En otra experiencia de inducción con dipirona, inhibidora de la síntesis de prostaglandinas, hemos observado la viabilidad celular a las 82 hs por incremento de la proliferación celular consecuente al agregado exógeno de glucosa pura.
En sangre incubada durante 48 horas en medio autólogo mínimo, sin inducir por agentes físicos, químicos o biológicos; se observa, entre otras patentes de lesión celular, la microvacuolización nuclear y citoplasmática. Acaso ocurran lesiones múltiples de membrana y otras estructuras celulares por acción de radicales libres generados por el propio metabolismo celular. Estas consideraciones serían una prueba concluyente de que la radiación al formar en la membrana celular cilindros de ionización y activar el sistema reparacional, inhibiría los daños de membrana ocasionados por los radicales libres, impidiendo la formación de vacuolas. Parecería probable también que las células, al involucionar o desdiferenciarse, podrían acomodar su metabolismo a esa involución, con eliminación de los R.L. (consumidos en la inducción de la proliferación) y/o con incremento de la actividad reparadora. Hemos observado en otras experiencias de inducción con sistemas generadores de radicales libres, que éstos podrían tener un efecto mitótico sobre las células que, como los neutrófilos, están en la fase Go del ciclo celular, por una acción sobre los genes responsables de la especialización.
Para estudiar los efectos biológicos del choque directo y de la acción indirecta de la radiación, debemos conocer las características de los distintos componentes celulares en relación a la electrodensidad y al contenido de agua y lípidos peroxidables, respectivamente; pero excede los límites del presente trabajo.
Diremos solo que agua constituye la mayor parte de la célula. En los tejidos animales forma el 75 por ciento del peso total. En algunos casos, por ejemplo en los mixomicetos, puede llegar al 94 por ciento del total. Los hongos mucosos o mucilaginosos podrían ser empleados, entonces, en modelos de efecto peróxido maximizado, y la radiosensibilidad que posean podría ser una medida de la importancia del efecto indirecto de la radiación en el fenómeno radiobioclástico total.
Se debería observar en estos casos un cambio tincional de las células fungales por alteraciones (peroxidaciones) de los lípidos de membrana. Esto dependería de la acción de tales lípidos en la entrada o retención del colorante, de las características del pigmento empleado, y del mecanismo involucrado en el sistema de coloración; pero también excede los límites del presente.
Esporas de hongo Penicillum comunne sin irradiar tincionadas con violeta de genciana. Solo unos pocos mutantes toman el colorante.
Esporas de hongo Penicillum comunne tras 9 horas de exposición radioactiva, tincionadas con violeta de Genciana, la mayoría de las esporas toma el colorante.
Las sustancias sólidas que componen la célula representan casi el 20 por ciento de ésta, de los cuales un 10 por ciento es de proteínas, un 3.5 por ciento es de lípidos, un 1.5 por ciento es de minerales. Si bien probabilísticamente podrían ocurrir más ionizaciones de las moléculas de agua que de otros constituyentes celulares, por encontrarse aquella en mayor cantidad, existen muchos factores a considerar:
1- Los radicales libres son muy inestables y altamente reaccionantes, debido a lo cual su vida media es del orden de los segundos.
2- Los radicales libres originados por el efecto radioactivo sobre el agua citoplasmática, reaccionan con las peroxidasas celulares, con los lípidos de membrana citoplasmáticos, y con las estructuras o compuestos celulares de elevada densidad electrónica, que estuvieran en sus vecindades.
3- Los radicales libres con mayor probabilidad de producir una daño directo sobre el genoma serían los producidos en la zona citoplasmática perinuclear y en el núcleo celular.
4- De acuerdo a las consideraciones anteriores el fenómeno probabilístico en función del elevado porcentaje de agua celular, se vería reducido en más del 50 por ciento, en lo que a acción directa sobre el DNA se refiere, principalmente en los casos de irradiación con dosis bajas.
5- Considerando una zona hipotética integrada por el núcleo y un halo perinuclear o subendoplasma virtual, podría ser mayor el volumen nuclear respecto al halo perinuclear de acuerdo a las características celulares. Los linfocitos, por ejemplo tienen un elevado volumen nuclear respecto al citoplasmático, que sería probabilísticamente más atacado por el bombardeo radioactivo, que el halo perinuclear.
6- El efecto peróxido a analizar respecto a los daños que pudiera ocasionar de modo directo sobre el DNA nuclear, independientemente del tamaño del citoplasma celular, sería fundamentalmente el surgido por consecuencia del impacto radioactivo sobre el agua nuclear, y esto depende en mucho del estado de hidratación de las estructuras cromatínicas, las que se encuentran más dispersas en las células en interfase, que son metabólicamente muy activas, y en las células embrionarias.
Las lipoproteínas están constituidas por una proteína y un lípido. Se encuentran fundamentalmente en la membrana plasmática y en las mitocondrias, estructuras que también serían atacadas por los radicales libres surgidos del efecto peróxido y que concurrirían a producir peroxidación de lípidos; alterando la permeabilidad, los potenciales de membrana, y la respiración aeróbica celular.
Obsérvese los cambios producidos por la inducción de sangre normal edetatada, cultivada en medio mínimo, con fluoruro de sodio, que es un inhibidor de diversos sistema enzimáticos y reduce la respiración celular y la glucólisis anaerobia. Al eliminar la respiración celular induce una cierta anaerobiosis, de modo que la célula debe metabolizar la glucosa en anaerobiosis pero encuentra bloqueada la ruta por acción del fluoruro. Se observan una paraforma inmadurativa de intensa regeneración (inferior) y un neutrófilo en apoptosis (inmediato superior).
Idem anterior, con fluoruro de sodio. Nótese la involución de un neutrófilo a una paraforma semejante a un metamielocito neutrófilo, y la apoptosis completada del neutrófilo superior.
La acción del impacto directo radiactivo tendría lugar, primordialmente, en el núcleo, aunque también ataca la membrana citoplasmática y nuclear, y otras estructuras de membrana, abriendo cilindros de ionización.
Los radicales libres formados por la acción indirecta de la radiación sobre el agua celular, producirían la peroxidación de los lípidos de membrana instalando una lesión más generalizada a ese nivel que el choque directo, y podrían interferir en la cascada oxidativa de la fosforilación mitocondrial oxidando a los equivalentes reductores e instalando la microaerobiosis o la anaerobiosis. También pueden atacar el DNA nuclear en los mismos sitios que el impacto balístico de la radiación.
La existencia del aparato de Golgi no puede demostrarse cuando las células se tratan con solventes de las grasas, y es positivo a la reacción de Millon y de las enzimas proteolíticas, debido a lo cual se encuentra constituido por lipoproteínas. El bajo peso específico del Golgi sugiere que es muy rico en lípidos, entre los que se encuentran cefalina, lecitina y esfingomielina. Es por ello que el aparato de Golgi sería un blanco de elección del efecto peróxido radioactivo, y por su ubicación perinuclear tomaría cuenta de los radicales libres surgidos por las acción del bombardeo radioactivo sobre el agua del hipotético halo perinuclear, impidiendo que los mismos lleguen en cantidad apreciable al núcleo celular. Esta situación avalaría nuestra suposición de que los radicales libres surgidos de la ionización del agua nuclear por la acción radioactiva, serían los únicos radicales involucrados en la lesión del DNA nuclear, que se sumarían a las lesiones producidas por el impacto directo de la radiación sobre el ácido nucleico.
La alta densidad electrónica de los ribosomas los haría, como al núcleo celular, un blanco predilecto de la acción radioactiva; de modo tal que los RNA soportarían en sus moléculas lesiones indirectas copiadas de las lesiones producidas sobre el DNA por la radiación, y lesiones directas de clivaje por el efecto impacto o peróxido del radionucleido. El resultado final sería la síntesis de proteínas anómalas, o la inhibición de la síntesis de proteínas como en los linfocitos, en los cuales la radioactividad puede inhibir la producción de anticuerpos.
Veremos luego que los cambios o lesiones en las inducciones por agentes tanto químicos como radioactivos, hacen blanco fundamentalmente en la heterocromatina nuclear, produciendo el desenrollamiento de la misma y permitiendo la expresión de genes callados, que se inhibieron en el proceso de diferenciación celular. Tales genes codifican la información para la síntesis de proteínas metabólicas y estructurales de la célula indiferenciada, debido a lo cual sería de esperar que en células no especializadas en la síntesis de proteínas la acción radiocitológica induzca la blastogénesis celular.
A las 4 hs de incubación del cultivo inducido con el radioiodo, se observan LPMNn con filamentos interlobulillares prácticamente inexistentes y redistribución de la cromatina; estadio que llamaremos, en adelante, ESTADIO I de lesión. Otros LPMNn muestran un núcleo unificado, amorfo, con agrumación de cromatina hacia los bordes nucleares, que denominaremos ESTADIO II de lesión. También se observan ESTADIOS III, con aspecto de metamielocitos y ESTADIOS IV con aspecto morfológico de mielocitos; todos ellos paraformas o pseudoformas de las formas.
Tales hallazgos demuestran, al menos, la existencia de una pseudoinmaduración. Otra entidad de idéntica dirección pero de distinto sentido, la pseudomaduración degenerativa, ha sido descripta con anterioridad y analizada por otros autores.
La pseudomaduración degenerativa fue descubierta en pacientes con tratamiento monodroga por leucemia mieloide aguda (LMA) y tales elementos fueron designados como paraneutrófilos. Se observaron luego en sujetos no tratados de mielosis aguda y se los vinculó con alteraciones citoquímicas varias relacionadas con las peroxidasas y los lípidos. Rohr, en Alemania, definió al respecto la existencia de toda una progenie directa y anormal de elementos dismórficos. En 1963 el concepto fue extendido a la eritroleucemia por Catovsky y colaboradores, y confirmado por Etcheverry y Suarez en 1967. Finalmente Killmann incorporó el hallazgo de esos elementos a la displasia hematopoyética o estado preleucémico. (6)
Los caracteres morfológicos del neutrófilo de pseudomaduración degenerativa, consisten en un asincronismo morfoestructural de maduración, demostrado por lobulación del núcleo, cromatina inmadura para ese grado de lobulación y masa nuclear francamente aumentada respecto a la citoplasmática. (6)
Sangre de Leucemia mieloide crónica en tratamiento monodroga. Nótese la presencia de un metamielocito en el borde superior (a las 12) y un paraneutrófilo de pseudomaduración o de intensa regeneración en el borde inferior (a las 7).
En el caso experimental que nos ocupa, se observa un asincronismo morfoestructural de inmaduración, demostrado por deslobulación del núcleo, núcleo único con una madurez de la cromatina que no condice con ese estado nuclear, pero masa nuclear grande que aumenta la relación núcleo-citoplasmática.
En algunos leucocitos polimorfonucleares involucionados a estadio IV, según observaremos en las microfotografías, se encuentra la aparición de vacuolas nucleares, de nucleolo en anillo o de cromosoma en anillo, engrosamiento de la membrana nuclear y frecuentes organitos citoplasmáticos.
Las vacuolizaciones producidas en algunos LPMNn y eosinófilos por el presente modelo, son mucho menores cualitativa y cuantitativamente que en las experiencias de morfogénesis inducida con sustancias oxidantes y R.L., y más frecuentes las nucleares que las citoplasmáticas. Esto evidenciaría que la radioactividad produciría más perturbaciones en la membrana del núcleo que en la del citoplasma, lo cual es obvio si consideramos que es una zona más electrodensa.
A las 24 horas de exposición al radionucleido va creciendo el porcentaje de células blastoideas, con una neta orientación hacia el predominio de estadios III y IV de pseudoinmaduración.
Con 56 horas de exposición al radioiodo se comienza a observar heterocromatinización nuclear, lo que supone una inhibición de genes que dejarían de estar expuestos al sistema de copias y duplicación nuclear.
Nótese los acúmulos de heterocromatina en el núcleo unilobular del neutrófilo irradiado.
Posteriormente se acentúan las masas de cromatina y comienzan a producirse delecciones.
Nótese un cromosoma deleccionado con aspecto de micronúcleo.
Los cambios producidos en leucocitos a las 56 horas de exposición radioactiva nos demostraría una vez más la viabilidad de los mismos durante ese período, en sangre entera cultivada en medio antólogo mínimo. Tal viabilidad la hemos demostrado en una experiencia de fagocitosis fúngica lenta en medio privado de calcio; y es observable también en una experiencia de inducción con radicales libres del peróxido de hidrógeno y del cobre, a las 92 horas de la venipuntura. Según algunos autores, la misma sería de hasta 15 días o más en leucocitos cultivados en coágulo plasmático autólogo blando; y al ser puesta de manifiesto por nosotros en un fenómeno biológico tan impresionante como la fagocitosis, nos demuestra la integridad funcional de las vías metabólicas celulares en tales condiciones de cultivo.
Recurriendo a la enzimología observamos que las reacciones cinéticas se producen, aunque en menor cuantía, a temperatura acorde con la del ambiente. Por otro lado, las enzimas son proteínas que actúan como catalizadores de reacciones químicas y, como tales, no alteran la dirección de la reacción (salvo en el alosteronismo) sino la velocidad de la misma; por disminución de la energía de activación necesaria. A medida que se eleva la temperatura aumenta la velocidad de la reacción llegando a un valor óptimo o máximo luego del cual desciende rápidamente a cero.
El valor Q10 o aumento de la actividad por cada 10ºC de elevación de la temperatura, varía entre 1.6 a 2.3, con una media de 2.0; si consideramos que la temperatura fisiológica va desde los 31ºC a los 45ºC, a la temperatura ambiente media las reacciones biológicas se desarrollarían en el doble de tiempo, que en condiciones fisiológicas algo extremas, y en el cuádruple de tiempo que en condiciones fisiológicas óptimas. A la temperatura ambiente, sin embargo, determinados procesos se retardan y otros se aceleran al doble o más, de la velocidad con que transcurren en condiciones fisiológicas. (1)
El efecto de la temperatura es el resultado de dos fenómenos, el aumento de la velocidad de la reacción química por aumento de la temperatura y el incremento de la velocidad de desnaturalización de la enzima y pérdida de la actividad catalítica. La T óptima para la mayoría de las enzimas se encuentra entre 37-42ºC, mientras que se tornan inactivas a T superiores a 50-55ºC. (1)
También resulta una prueba de viabilidad las escasas células observadas, a las 56 horas, con evaginaciones citoplasmáticas y cariólisis, porque eso nos demuestra la existencia de un mecanismo reparacional intenso de las membranas dañadas por el bombardeo radiactivo. En realidad, las evaginaciones y burbujas citoplasmáticas no se deben interpretar siempre como patentes de lesión de membrana; sino que pueden corresponder, según el resto del estado celular, a signos de intenso movimiento citoplasmático y de intensa actividad. (9)
Acción del 125 Iodo sobre leucocitos de sangre periférica (LSP) de leucemia mieloide crónica (LMC).
Con el propósito de observar la acción del radioiodo sobre elementos inmaduros de la serie granulocítica, se efectuó una nueva experiencia con 100 µl de sangre entera en medio autólogo mínimo, correspondiente a paciente de sexo masculino, de 22 años de edad, con padecimiento de leucemia mieloide crónica (LMC) y antecedentes de ACV por TE.
Microfotografía de muestra de sangre de leucemia mieloide crónica a pequeño aumento.
Microfotografía de muestra de sangre de leucemia mieloide crónica a aumento intermedio
Microfotografía de muestra de sangre de leucemia mieloide crónica a gran aumento
Microfotografía de muestra de sangre de leucemia mieloide crónica a gran aumento
Se redujo la cantidad de trazador a 20 µl a los fines de evaluar si dosis menores del radionucleido seguían siendo efectivas en la morfofenogénesis celular inducida. Se efectuaron extendidos a las 8 y 24 horas de incubación con posterior tinción con MGG convencional.
En las microfotografías obtenidas se observa la notoria diferencia de las poblaciones antes y después de irradiar.
A las 8 horas se observa una tendencia a la polilobulación de blastos, es decir, una pseudomaduración degenerativa con agrumación de cromatina y citoplasma basófilo.
A las 24 horas se nota una mayor compactación de la cromatina, con núcleos más irregulares y bordes nucleares cortados a neto.
Más adelante comienza a pronunciarse la polilobulación y la compactación de la cromatina, con cúmulos groseros.
Parece interesante la relación entre los dismorfismos observados por la acción de la radiación, sobre sangre normal y leucémica, induciendo en el primero de los casos una pseudoinvolución degenerativa con blastogeneización de neutrófilos maduros y en el segundo una pseudomaduración degenerativa con polilobulación de blastos. En éste último caso se observa una intensa basofilia citoplasmática debido a intensa síntesis ribosomal de proteínas, es decir que los elementos de la progenie radioinducidos hacen una pseudomaduración nuclear pero conservan la inmaduración citoplasmática.
Al parecer la radioactividad actúa sobre un mismo operón inhibiendo o activando los genes de la maduración, es decir, los genes responsables de la diferenciación y especialización celular. Este hecho estaría demostrado, en parte, por la inhibición por causa de la radioactividad de las enzimas de adaptación bacterianas (5), que son las que se producen en las células por influencia de la presencia del sustrato. Por ejemplo, en un cultivo de células carentes de una determinada enzima, efectuado en un medio adicionado con el sustrato específico de tal enzima, sobrevivirán únicamente los mutantes capaces de fabricar la enzima de adaptación; la cual es capaz de destruir si es nocivo o de asimilar si es nutritivo el sustrato incorporado. La radiación inhibe, dijimos, las enzimas de adaptación, y como éstas tienen íntima relación con la multiplicación bacteriana en medios no propicios, se deduce que la radiactividad ataca directa o indirectamente los genes donde se cifra la diferenciación y especialización celular, necesaria en este caso para no sucumbir en el medio adverso.
Los efectos radiobiológicos sobre células adultas diferenciadas y sobre elementos de la progenie, de los granulocitos neutrófilos, se producen con cierto asincronismo núcleo citoplasmático de las paraformas inducidas. La involución de las células especializadas ocurre con presencia de núcleos pelgerizados, sin lobulación nuclear, a veces con nucleolos, todo lo cual habla de un cierto estado de inmaduración nuclear; y sin basofilia citoplasmática, es decir conservando la maduración citoplasmática del neutrófilo diferenciado. Por lo que la acción de la radioactividad sobre células adultas consistiría, en definitiva, en una inmaduración nuclear.
La evolución anómala de los elementos de la progenie, expuestos a la radioactividad, ocurre con lobulación y heterocromatinización nuclear, es decir con maduración nuclear; y con intensa basofilia citoplasmática que denota una conservación de la inmaduración del citoplasma. Por lo que el efecto radiobiológico sobre células inmaduras consistiría en la inducción de la maduración nuclear. Esto corrobora que el efecto del choque directo radioactivo no altera al citoplasma de las células y que es un fenómeno de ocurrencia fundamentalmente nuclear.
Conclusión:
La delección cromosómica observada en la microfotografía nos demuestra que las aberraciones cromosómicas ocurridas son de doble golpe, como las que ocurren con dosis mayores de exposición. Las mismas, sin embargo, no alcanzan a superar el mecanismo de defensa de las peroxidasas celulares, y ocurre el choque radiactivo como único evento radiocitológico en el neutrófilo, con connotaciones fundamentalmente nucleares.
La microvacuolización hidrópica es una patente de lesión de membrana por peroxidación de lípidos y no se observa en la exposición radioactiva del neutrófilo, por ausencia en el mismo del efecto peróxido radioactivo.
El neutrófilo envejecido tiene la heterocromatina tan abigarrada que no sufre alteraciones por el choque radioactivo de doble golpe. La heterocromatina cuando no está sobre abigarrada es el blanco predilecto del choque directo, que expresaría genes reprimidos que hacen al estado de diferenciación de la célula, indiferenciándola en algún grado.
Los leucocitos polimorfonucleares neutrófilos resultan la especie de elección para el estudio del choque directo de la radioactividad, y se brindan en este trabajo las patentes de lesión del neutrófilo irradiado, que afectan fundamentalmente al estado de maduración del núcleo celular.
Referencias Bibliográficas:
1. J.L. Bennington, Diccionario Enciclopédico del Laboratorio Clínico, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina, 1991.
2. Klein y Dodinval, La genética humana a servicio de la medicina, Ediciones Roche, Basielea, Suiza, 1981.
3. N.P. Dubinin, Genética General, Editorial Mir, Moscú, 1981.
4. S.L. Robbins, Patología estructural y funcional, Editorial Interamericana, México, 1975.
5. Tratado de Microbiología, W. Burrows, Editorial Interamericana, México, 1965.
6. V.J. Grignaschi, Diagnóstico citológico de las hemopatías, Editorial Médica Panamericana, Madrid, 1991.
7. R.K. Murria, D.K.Granner, P.A. Mayes, V.W. Rodwell, Bioquímica de Harper, Editorial El Manual Moderno, México D.F., 1994.
8. F. Molinero Somolinos, Trasplantes, Aula abierta Salvat, Madrid, 1985.
9. Henri Firket, La célula viva, Editorial Universitaria de Buenos Aires, Argentina, 1988.
10. F. Ballesta Martinez, A.B. Vázquez, Cromosomopatías autosómicas, Editorial Espaxs, Barcelona, 1971.
11. Lynch, Raphael, Mellor, Spare, Inwood, Métodos de Laboratorio segunda edición, Nueva Editorial Interamericana, México, 1972.