Comparación de tres métodos para la determinación de microalbuminuria.

MSc. Vita Calzolaio. Dpto. Ciencias Morfológicas y Forenses de la Universidad de Carabobo. Escuela de Ciencias Biomédicas y Tecnológicas. Profesora Instructor
MSc. Amarily Perelli. Dpto. de Formación Integral del Hombre. Facultad de Odontología. Universidad de Carabobo. Profesora Instructor
Dra. Emy González. Investigadora del Laboratorio de Investigación y Postgrado de la Escuela de Bioanálisis-sede Valencia. Universidad de Carabobo.
Dra. Rosalina González. Dpto. de Investigación y Desarrollo Profesional. Escuela de Bioanálisis-sede Carabobo. Universidad de Carabobo. Profesora Titular
Lic. Alastre Daniela. Licenciada en Bioanálisis egresada de La Universidad de Carabobo
Lic. Anhil Angulo. Licenciada en Bioanálisis egresada de La Universidad de Carabobo
Lic. Tamara Aranguiz. Licenciada en Bioanálisis egresada de La Universidad de Carabobo

Resumen:

La microalbuminuria se define como una pequeña cantidad de proteína (albúmina) presente en la orina, en cantidades no evidenciables por los métodos tradicionales utilizados en el laboratorio, lo que hace imposible su captación a través de dichos procedimientos. La cuantificación de ésta es fundamental en el diagnóstico y seguimiento de las patologías renales. El objetivo de este estudio fue comparar tres métodos: la cinta reactiva, el método inmunoturbidimétrico y el método inmunológico de fase sólida (Nycocard), utilizando concentraciones conocidas para evidenciar cuál de éstos produce resultados reproducibles, exactos y fiables. La población y muestra estuvo conformada por patrones elaborados a partir de una solución madre de albúmina de 20g%.

Se prepararon patrones de 3, 7, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125 y 150 mg/L. La ejecución del método inmunoturbidimétrico, se realizó siguiendo el protocolo indicado en el inserto del kit Spinread, cuya lectura se realizó en un Stat fax Milleniun III a la longitud de onda indicada. Todos los patrones se midieron con la cinta reactiva Micraltest, comparando el color obtenido con la cartilla de colores provista por el producto, cuyas concentraciones son 20, 50 y 100 mg/L. Por último se realizaron las determinaciones con el método inmunológico en fase sólida de tipo sándwich los cuales fueron medidos en el densitómetro fotocolorímetro Nycocard Reader II. Encontrando que, la cinta reactiva Micraltest resultó altamente sensible en la detección de microalbuminuria, aunque es un método sencillo de bajo costo, los resultados deben ser confirmados por los métodos cuantitativos. El método inmunoturbidimétrico evidenció ser una prueba adecuada para el diagnóstico y cuantificación de la microalbuminuria, sin embargo, el método Nycocard es la técnica que mostró resultados reproducibles con mayor precisión y exactitud en cuanto a las concentraciones de los patrones medidos.

Palabras clave: Microalbuminuria, Patrones, Inmunoturbidimetría, Cintas Micraltest, Elisa fase sólida.

Abstract:

Microalbuminuria was defined as a small amount of protein (albumin) in urine in quantities not warranted by the traditional methods used in the laboratory, making it impossible to capture through the procedures. Its assessment is essential in the diagnosis and monitoring of renal pathology. The aim of this study was to compare three methods: the tape strip, the immunoturbidimetric method and solid phase immunological method (NycoCard) using known concentrations to demonstrate which of these produces reproducible, accurate and reliable. The population and sample consisted of patterns made from a stock solution of 20 g% albumin.

Patterns were prepared 3, 7, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125 and 150 mg/L. Immunoturbidimetric method execution was carried out following the protocol described in the kit insert Spinrad, whose reading was performed on a Stat Fax Milleniun III to the wavelength indicated. All patterns were measured with reactive Micraltest tape, obtained by comparing the color with the color chart provided by the product, whose concentrations are 20, 50 and 100 mg/L. Finally, we performed the measurements with the immunological method solid phase sandwich which were measured on the densitometer photocolorimeter NycoCard Reader II.

Finding that the tape was highly sensitive Micraltest reactive in the detection of microalbuminuria, while a simple low-cost method, the results must be confirmed by quantitative methods. Immunoturbidimetric method showed to be an appropriate test for the diagnosis and quantification of microalbuminuria, however, the method is the technique NycoCard showed reproducible results with greater precision and accuracy in the measured concentrations of the standards

Palabras clave: Microalbuminuria, Patterns, immunoturbidimetric, Micraltest Tape, Elisa solid phase

Introducción

La enfermedad renal ha adquirido en los últimos años las proporciones de una verdadera epidemia. Conforme avanza la enfermedad la capacidad filtradora del riñón disminuye, aunque durante la mayor parte de la enfermedad el paciente no presenta síntomas de daño renal, existe sin embargo una proteinuria que no es evidenciable por los métodos tradicionales de laboratorio, y es precisamente la medida de esta pequeña cantidad de proteínas lo que permite evaluar la extensión de la lesión del riñón.

La microalbuminuria se define como una pequeña cantidad de proteína (albúmina) presente en la orina, en una concentración de 30 a 300mg/24 horas, la cual es inferior a la cuantía detectada por los métodos utilizados para la determinación de proteínas en orina, lo que hace imposible su captación a través de dichos procedimientos. La presencia de una proteinuria importante es el resultado de un aumento de la permeabilidad glomerular y por consiguiente signo de enfermedad renal en donde el grado de excreción proteica se relaciona con la progresión de la misma.

Este parámetro le permite al nefrólogo diagnosticar en forma temprana la presencia de daño renal y poder revertir el proceso, ya que en este rango de excreción esta patología es potencialmente reversible si se toman las medidas adecuadas. (1,2).

La microalbuminuria es un marcador de enfermedad sistémica y un índice temprano de la alteración glomerular. Se le ha asociado con trastornos renales y cardiovasculares, disfunciones a nivel endotelial, dislipidemias, hipertensión arterial sistémica, hepatopatías, nefropatía y síndrome metabólico. (3). A pesar de esto, existen otras condiciones que pueden producir microalbuminuria transitoria, como el ejercicio intenso, las infecciones de las vías urinarias, las enfermedades febriles agudas, la menstruación, la variabilidad biológica, los fármacos antiinflamatorios y los cálculos renales. (4,5).

En vista de esto, la cuantificación de microalbuminuria es fundamental en el diagnóstico y seguimiento de las patologías mencionadas. Esta debe realizarse anualmente a todas las personas que presenten estas patologías y cada 6 meses a aquellos pacientes con tratamiento antihipertensivo durante el primer año de tratamiento para evaluar el impacto.

En la actualidad, existen en el mercado diferentes métodos para la detección de la microalbuminuria, siendo su determinación en el laboratorio un proceso simple, a través del cual se puede obtener en pocos minutos un resultado. Estos resultados obtenidos van a influir decisivamente en el diagnóstico y tratamiento médico, por lo que la calidad de la información generada debe ser un objetivo prioritario y se basa en la calidad del trabajo analítico. Entre los métodos de laboratorio que permiten su determinación se pueden mencionar: los cualitativos en los que se emplean las cintas reactivas y los valores obtenidos son reportados como positivos o negativos; los semicuantitativos, en el que los resultados obtenidos son comparados con una escala de color que representan determinadas concentraciones y los cuantitativos en donde se utilizan un reactivo especifico obteniéndose concentraciones determinadas que varían según la técnica empleada. (6).

Diversos autores han puesto su mirada en el comportamiento de los métodos que permiten la determinación de la microalbuminuria, es así como en el año 1992, Marshall y col., evaluaron las cintas Micral-Test en muestras de orinas matutinas en la escuela de Medicina de Framlington Reino Unido, las cuales contenían concentraciones de albúmina entre 0,4-440 mg/L determinadas por radioinmunoanálisis. Las muestras provenían de 112 pacientes diabéticos. De éstas, sólo 34 mostraron concentraciones ≥ 20 mg/L y 78 con concentraciones < 20mg/L. Estas fueron correctamente identificadas por la cinta dando un 100% de sensibilidad y 91% de especificidad, concluyendo que la cinta es sensible y específica para la determinación semicuantitativa de albúmina. Pero en aquellos pacientes con concentraciones < 20 mg /L solo requieren la repetición de la prueba anualmente; al contrario, los pacientes con concentraciones ≥ 20mg / L requieren otras pruebas que cuantifiquen la tasa de excreción de albúmina. De igual forma concluyeron que el tiempo de lectura es crítico para la estimación de la concentración del parámetro, ya que las cintas leídas después de 4-5 minutos mostraron una sobreestimación del parámetro.(7)

En 1993, Jensen y col. evaluaron el desempeño de la cinta reactiva Micral Test validando los resultados obtenidos con el método ELISA, en 1359 muestras de pacientes que asistían al Steno Diabetes Center, de Gentofte, Dinamarca. La sensibilidad, especificidad y especificidad diagnóstica obtenida con la cinta fue de 92, 58 y 12% respectivamente. En conclusión, la cinta resultó altamente sensible en la detección de microalbuminuria a pesar del alto número de falsos positivos obtenidos cuando se le comparó con el método de ELISA. (8)

También en 1998, Solanas y col. en el Centro de Salud Trinitat de Valencia, España, evaluaron los métodos para la determinación de microalbuminuria en 64 muestras de pacientes con diabetes mellitus no insulino dependientes. Para esto, se realizó la determinación de microalbuminuria a través de las cintas reactivas Micral Test y Microbumintest en muestras de orina matutina, corroborando los resultados conseguidos con las cintas con el método inmunoturbidimétrico. Utilizadas en conjunto, las cintas obtuvieron una sensibilidad del 75% y una especificidad del 44% cuando se les comparó con el método inmunoturbidimétrico, concluyendo que los métodos semicuantitativos para microalbuminuria, como estas cintas, tienen un uso limitado en atención primaria debido a que su sensibilidad y su valor predictivo de resultados negativos no son aceptables como método de diagnóstico inicial. (9)

Seis años más tarde, en el 2004, en el Hospital Regional de LaPorte, USA, Busby y col. realizaron una comparación entre la cinta reactiva y los métodos que utilizan la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en pacientes con enfermedad renal, concluyendo que estas nuevas metodologías son muy sensibles para la detección de este parámetro y proveen información de mucha utilidad para la identificación de pacientes de alto riesgo. Sin embargo, concluyeron que la cinta reactiva presenta la ventaja de permitir el diagnóstico de dichos pacientes de una manera rápida debido a que no es un método tan complejo para desarrollar como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). (10)

Actualmente se encuentran en el mercado diversos métodos para determinar una amplia gama de parámetros de gran importancia, como la microalbuminuria; entre estos métodos, algunos proporcionan resultados cuantitativos, tales como el radioinmunoensayo, la nefelometría, la turbidimetría y la inmunodifusión radial; también se encuentran otros métodos que brindan resultados rápidos y de manera semicuantitativa como lo son las tiras reactivas que se emplean específicamente para la valoración de la microalbuminuria.

El principal factor en la evaluación de métodos lo constituye el conjunto de sus especificaciones analíticas. Esta capacidad se expresa como precisión, sesgo, exactitud, linealidad, límite de detección, intervalo de medición, sensibilidad analítica, especificidad (si corresponde). Dicha información la provee el fabricante, pero se debe verificar el grado en que esas especificaciones se cumplen en el laboratorio. Es decir, verificar las prestaciones reales en las condiciones de trabajo del laboratorio. (11)

La detección de la microalbuminuria debería ser un examen de rutina en Venezuela, tal como ocurre en países desarrollados, debido a que éste es un parámetro de gran utilidad para la detección del daño renal incipiente en etapas en las que no existe aún evidencia clínica. Además, es utilizado para evaluar la progresión de enfermedades como diabetes e hipertensión arterial. La detección de microalbuminuria puede funcionar como método de diagnóstico o control de las patologías antes mencionadas, ya que es un método útil, sencillo y eficaz.

En esta investigación se pretende brindar una visión más detallada sobre el comportamiento de estos métodos de detección, de modo que el analista pueda dar garantía que los resultados obtenidos a través de ellos son exactos y revelan el verdadero estado del paciente; del mismo modo se busca conocer cuál de estas técnicas desde el punto de vista coste-beneficio es la más idónea para la determinación de microalbuminuria en aquellos pacientes que tienen riesgo de presentar daño renal.

En Venezuela, la determinación de la microalbuminuria no es una prueba de rutina en el laboratorio clínico. Sin embargo, el método semicuantitativo más utilizado es el de la cinta reactiva y como métodos cuantitativos, suele usarse el inmunoturbidimétrico o el método de Elisa fase sólida Nycocard. Debido a que estos métodos son los más aplicados en el laboratorio clínico, las investigadoras se plantearon comparar los resultados del método inmunoturbidimétrico, el método Elisa fase sólida Nycocard y el método de la cinta reactiva, para la determinación de microalbuminuria utilizando diferentes concentraciones conocidas de albúmina.

Materiales y Métodos

El trabajo de investigación está enmarcado en un diseño no Experimental de tipo transeccional; ya que las variables no fueron manipuladas, se observó el evento tal y como ocurrió en su contexto original y la recolección de los datos se realizó en un momento único para su procesamiento. Es descriptivo, porque los datos recolectados mostraron un fenómeno que ocurrió con la mayor precisión posible. (12,13).

En la presente investigación se describió el comportamiento de tres métodos para la determinación de la microalbuminuria utilizando para ello diversas concentraciones conocidas de albúmina, de modo de dilucidar cuál de los métodos utilizados fue el más preciso, exacto y confiable para la determinación de dicho parámetro.

A partir de una solución madre de albúmina al 20%, se prepararon patrones de 3, 7, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125 y 150 mg/L, los cuales conformaron la población y muestra de este estudio, para así poder realizar la comparación entre los métodos objetos de la presente investigación.

Se obtuvo una muestra de orina parcial matutina, a la cual se le midió la densidad y el pH con las cintas para análisis de orina ComburTest. Se llevó a pH neutro con NaOH al 10% y se centrifugó la muestra, debido a que estas son condiciones señaladas por la casa fabricante como tratamiento previo de la muestra para la ejecución de las técnicas. A partir del reactivo de albúmina concentrado, se calcularon los volúmenes a medir y se prepararon soluciones de 3, 7, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125 y 150 mg/L, utilizando el sobrenadante de la orina previamente centrifugada. Dichos rangos abarcaron los valores inferiores, medios y superiores a los establecidos por las técnicas ejecutadas para la determinación de microalbuminuria, una vez obtenidas las diversas soluciones de concentración conocida, se procedió a tomar tres alícuotas de cada una, y se les determinó el valor de la microalbuminuria por la cinta reactiva, por el método turbilátex y por el método Elisa fase sólida Nycocard.

Para el método inmunoturbidimétrico, se estandarizó la técnica, el reactivo de trabajo y todos los ensayos de las soluciones fueron ejecutado a temperatura ambiente siguiendo el protocolo indicado en el inserto del kit de marca Spinread turbilátex. La longitud de onda utilizada fue 545nm – 600nm la cual fue medida en un fotocolorímetro Stat fax milleniun III.

En cuanto a la medición con la cinta reactiva, se siguió el procedimiento indicado por la casa comercial Micraltest, en el cual se sumergía la cinta por 5 segundos y realizaba la lectura luego de transcurrido el minuto exacto, no más de cinco minutos. Posterior a esto se comparó la coloración obtenida con la cartilla de colores que indican las concentraciones específicas señaladas por el fabricante las cuales corresponden a 20, 50 y 100 mg/L.

Posteriormente se procedió a realizar las determinaciones con el método inmunológico en fase sólida de tipo sándwich, donde cada uno de los patrones preparados fué medido en un densitómetro fotocolorímetro Nycocard Reader II.

Estas técnicas se realizaron en el Laboratorio de Investigación y Postgrado de la Escuela de Bioanálisis (LIPEB).

Determinación de Microalbuminuria por el método Turbilátex.

Fundamento: Es un ensayo turbidimétrico para la cuantificación de microalbúmina en orina humana. Las partículas de látex recubiertas con anticuerpos anti-albúmina humana, son aglutinadas por la microalbúmina presente en la muestra del paciente. El proceso de aglutinación provoca un cambio de absorbancia proporcional a la concentración de microalbúmina de la muestra y por comparación con un calibrador de albúmina de concentración conocida se puede determinar el contenido de microalbúmina en la muestra ensayada.

Valores de Referencia: hasta 15 mg/L.

Determinación de Microalbuminuria por el método de la Cinta Reactiva.

Fundamento: Al impregnar la cinta con la orina, la albúmina presente en la muestra se combina con un conjugado soluble de antialbúmina-galactosidasa, el cual se haya fijo en la cinta. El complejo albúmina- anticuerpo- galactosidasa y el exceso del conjugado se dejan eluir en un área que contiene albúmina fijada, donde se captura el exceso de conjugado. Este complejo pasa posteriormente a una almohadilla que contiene el sustrato, donde la galactosidasa reacciona con el rojo de clorofenol, provocando un cambio de color que va desde amarillo hasta rojo. Posterior a la incubación a temperatura ambiente, se compara el color de la cinta con la cartilla de colores que provee el producto. Estos colores se corresponden a concentraciones de 0, 20, 50, y 100 mg/L, los cuales proveen una estimación semicuantitativa de la concentración de albúmina.

Valores de Referencia: entre 0-20 mg/L.

Determinación de Microalbuminuria por el método Elisa fase sólida NycoCard.

Fundamento: Es un test inmunológico en fase sólida de tipo sándwich. La placa test contiene una membrana recubierta de anticuerpos monoclonales inmovilizados específicos de la albúmina. Cuando la muestra diluida se deposita sobre la placa test, los anticuerpos inmovilizados sobre la membrana capturan las moléculas de albúmina contenidas en la muestra. La albúmina se une por una reacción tipo sándwich a los anticuerpos marcados conjugados impregnados en la membrana. El exceso de conjugado es eliminado de la membrana con una solución de lavado. El filtro de papel situado sobre la membrana absorbe el exceso de líquido. Las partículas de oro unidas provocan una coloración de la membrana, la intensidad de coloración es proporcional a la concentración de albúmina en la muestra. Esta intensidad es medida cuantitativamente con la ayuda de un densitómetro colorimétrico Nyco Card reader II.

Valores Normales < 20mg/L

Rango de medida es entre 5 – 200 mg/L. Intervalo de medida de 1 mg/L

Análisis y Discusión

Una vez preparados los patrones con las concentraciones de 3, 7, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125 y 150 mg/L, se procedió a realizar la determinación de la Microalbuminuria por las técnicas mencionadas. Para el método inmunoturbidimétrico, se estandarizó la técnica y se siguió el protocolo indicado en el inserto del kit marca Spinread, cuya lectura se realizó en un fotocolorímetro (Stat fax Milleniun III) a la longitud de onda indicada. Con relación a la cinta reactiva Micraltest, se midieron todos y cada uno de los patrones preparados comparando el color obtenido en la cinta con la cartilla de colores provisto por el producto, cuyas concentraciones corresponden a 20, 50 y 100 mg/L. Posteriormente se procedió a realizar las determinaciones con el método inmunológico en fase sólida de tipo sándwich los cuales fueron medidos en un densitómetro fotocolorímetro Nycocard Reader II. A continuación se presentan los resultados.

Tabla Nš 1. Concentración de Microalbuminuria a través del método Inmunoturbidimétrico 

Al observar los resultados plasmados en la tabla Nš 1, se puede apreciar que las concentraciones obtenidas son similares a la de los patrones preparados, sin embargo, cabe acotar que para los patrones de 50 y 100mg/L, las concentraciones determinadas tienen un rango de variación amplio en comparación a los obtenidos para el resto de los patrones. El patrón de 150 mg/L cuyo valor arrojado no se acerca al esperado, pudiera deberse a que éste se acerca al punto máximo de linealidad de la técnica y se encuentra en el límite superior de detección. Para esta concentración el inserto del kit Spinread turbilátex señala realizar una dilución de la muestra 1:5 con NaCl 9 g/L, debido a que a partir de concentraciones superiores a 125 g/L la técnica pierde linealidad y la diluciones sucesivas que estas concentraciones requieren, pudiera explicar dicha variación. Es importante destacar que por ser este un método cuantitativo y arrojar valores coherentes que se acercan al valor real, se puede corroborar los resultados obtenidos por otros métodos semicuantitativos como la cinta reactiva, al igual que lo hicieron (9), quienes realizaron la determinación de microalbuminuria a través de cintas reactivas en muestras de orina matutina, corroborando los resultados conseguidos con las cintas con el método inmunoturbidimétrico. Igualmente (14), al comparar dos métodos turbidimétricos, concluyen que la variación entre los métodos pudo originarse en el proceso de calibración dependiendo del purificado de albúmina utilizado.

Se puede observar que los resultados obtenidos muestran variaciones en ciertas concentraciones de patrones; sin embargo estas diferencias entre la verdadera concentración del patrón y el valor arrojado no son realmente significativas mostrando ser un método sensible y de exactitud aceptable, para la detección de este parámetro y como método de diagnóstico.

Tabla Nš 2. Concentración de Microalbuminuria a través del método de la Cinta Reactiva Micraltest. 

7.- Marshall, S; Shearing, P; Alberti, K. Micral-Test Strips Evaluated for Screening for microalbuminuria. Clin Chem 1992;38:588-91
8.- Jensen, JS; Borch-Johnsen, K; Feldt-Rasmussen, BF; Jensen, G. Screening of microalbuminuria with the Micral-Test. A semi-quantitative urinary dipstick. PubMed. 1993;155(51):4155-7.
9.- Solanas, P; Soler Torro, JM; Ros Garcia, A; Fos Ibanez, V; Vento Torres, D; Prosper Sierra, M. Validity of semiquantitative methods of microalbuminuria screening in diabetes mellitus. Atem. primaria.1998;(10):631-5.
10.- Busby, D; Bakris G. Comparison of commonly used assays for the detection of microalbuminuria. The Journal of Clinical Hypertension. 2004;6(11);8-12.
11.- Mueller P, MacNeil M, Smith J, Miller D. Interlaboratory comparison of the measurement of albumin in urine. Clin Chem 1991; 37(2):191–5
12.- Ríos, A Metodologías, técnicas y estrategias de investigación en las jornadas españolas de documentación automatizada. FESABID 98. VI Jornadas Españolas de Documentación. 1998. Disponible (http://fesabid98. floridauni.es/ Comunicaciones/a_bele/ Ana%20Bele.htm). [Consulta: 2006, Mayo 6]
13.- Hernández, R; Fernández, C y Baptista, P. Metodología de la investigación. 3era edición, Editorial McGraw-Hill. México. 2003
14.- Parsons, M; Newman, D; Newall, R; Price, C. Validation of a Point-of-Care Assay for the Urinary Albumin: Creatinine Ratio. American Association for Clinical Chemistry, Inc. Technical Briefs 1999. [Revista en línea]. Disponible: http://www.clinchem.org/cgi/content/full/45/3/414 [Consulta 2007, Mayo 07]
15.- Cortes-Sanabria, L; Martinez-Ramirez, HR; Hernández, JL; Rojas-Campos, E; Canales-Munoz, JL; Cueto-Manzano, AM. Utility of the Dipstick Micraltest II in the screening of microalbuminuria of diabetes mellitus type 2 and essential hypertension. Rev. Invest .Clin. 2006. 58(3);190-7