INTRODUCCIÓN: La duplicación cromosómica es una anomalía estructural desequilibrada rara. En este trabajo, presentamos 5 casos de duplicación cromosómica, su repercusión fenotípica en los pacientes y la comparación con los fenotipos observados en casos similares referidos anteriormente en la literatura científica.
MATERIAL Y MÉTODOS: El estudio citogenético se realizó en cromosomas teñidos con bandas G y con técnicas de hibridación in situ por fluorescencia (FISH), para confirmar las anomalías.
Estudio de 5 casos de duplicación cromosómica y su relación con el fenotipo que presentan los pacientes.
Chromosomal duplication and its effect on phenotypical consequences in the patients. A study of five cases.
Benjamín Domingo Arrué (Alumno interno del Departamento de Patología de la Universitat de Valencia, estudiante de 3º de medicina de la Facultad de Medicina y Odontología de Valencia)
Teresa San Miguel
Concha López Ginés
Rosario Gil Benso (Catedrática de la Universitat de Valencia)
Departamento de Patología, Facultad de Medicina y Odontología, Universitat de Valencia
RESUMEN:
INTRODUCCIÓN: La duplicación cromosómica es una anomalía estructural desequilibrada rara. En este trabajo, presentamos 5 casos de duplicación cromosómica, su repercusión fenotípica en los pacientes y la comparación con los fenotipos observados en casos similares referidos anteriormente en la literatura científica.
MATERIAL Y MÉTODOS: El estudio citogenético se realizó en cromosomas teñidos con bandas G y con técnicas de hibridación in situ por fluorescencia (FISH), para confirmar las anomalías.
RESULTADOS: Se detectaron 5 duplicaciones cromosómicas que afectaron a los cromosomas 4, 7, 8, 9 y 10. Tres duplicaciones fueron en tándem, una invertida y una invertida con deleción distal. Cuatro pacientes presentaron anomalías fenotípicas y retraso psicomotor.
DISCUSIÓN: La duplicación cromosómica es una anomalía rara cuyas consecuencias fenotípicas son difíciles de predecir. Es de gran interés el estudio de nuevos casos para establecer la correspondencia entre los fragmentos duplicados y su repercusión fenotípica en los pacientes.
Palabras Clave: Anomalía cromosómica, duplicación cromosómica, citogenética, cariotipo, bandas G
INTRODUCTION: Chromosomal duplication is a rare unbalanced structural anomaly. We present 5 cases of chromosomal duplication and their phenotypical impact in the patients and compare them to other similar cases in literature.
MATERIALS AND METHODS: G-banded chromosomes were prepared from peripheral blood lymphocytes according to the standard protocols. Fluorescent in situ hybridization (FISH) with whole chromosome painting was also carried out to confirm the anomalies.
RESULTS: 5 chromosomal duplications on chromosomes 4, 7, 8, 9 and 10 were detected. Three were interstitial tandem duplication, another one was an inverted duplication and the last one was an inverted duplication deletion affecting chromosome 8. Four patients presented phenotypical anomalies and cognitive impairment.
DISCUSSION: Chromosomal duplication is an infrequent anomaly with difficult phenotypical changes to predict, therefore is really important to study new cases to better know the relation between involved regions and phenotypical anomalies.
Key Words: Chromosomal anomaly, chromosomal duplication, cytogenetics, karyotype, G-bands
1. INTRODUCCIÓN
Las anomalías cromosómicas estructurales suponen cambios en la forma normal de los cromosomas, que ocurren como consecuencia del reordenamiento de uno o varios fragmentos cromosómicos. Las consecuencias fenotípicas de estas alteraciones dependen de su naturaleza específica, del desequilibrio resultante de los fragmentos del genoma implicados, de los genes contenidos en dichos fragmentos y de la probabilidad de transmisión a generaciones sucesivas. La incidencia de estas anomalías es de 1 cada 375 nacidos vivos (1). Además, tal y como ocurre en las alteraciones numéricas, las anomalías cromosómicas estructurales pueden darse a nivel de todas las células del organismo o en forma de mosaico.
Las anomalías cromosómicas de estructura pueden ser de dos tipos: equilibradas y desequilibradas. En el primer grupo, se incluyen aquellas alteraciones que no modifican la cantidad de material genético y que, por tanto, no provocan alteraciones fenotípicas en el portador, aunque pueden ser transmitidas a la descendencia. Por otro lado, las cromosomopatías desequilibradas sí que van a tener repercusiones fenotípicas en el paciente, ya que conllevan pérdida o ganancia de material genético. Es en este último grupo en el que se incluyen las duplicaciones cromosómicas, que son reordenamientos en los que un fragmento cromosómico se encuentra repetido.
Las duplicaciones detectables por los métodos citogenéticos habituales son raras y comprenden un número variable de megabases. Se estima que su incidencia es aproximadamente de 1:4000 individuos en la población general (2). Las características fenotípicas que producen en los portadores comprenden en la mayoría de los casos, múltiples anomalías congénitas y retraso psicomotor. Se conocen duplicaciones de todos los cromosomas y de cualquier región de los mismos y su origen es generalmente de nueva aparición (3).
De acuerdo con la orientación del fragmento duplicado, las duplicación puede ser en tándem (directa) o invertida (figura 1).
Figura 1
En ambos tipos se produce un exceso de material genético, sin embargo, las duplicaciones invertidas se suelen asociar además con una deleción de la región distal del cromosoma duplicado (2).
Los mecanismos de formación de las duplicaciones cromosómicas pueden ser de varios tipos. El primer tipo es la duplicación espontánea, en el que se producen dos roturas, liberándose un fragmento que se duplica y se reincorpora. Es un mecanismo bastante extraño e infrecuente. La segunda causa de duplicación cromosómica es la más habitual y consiste en un fallo en la recombinación genética. En la recombinación genética de los cromosomas homólogos (durante el crossing-over), en lugar de intercambiarse fragmentos, un cromosoma cede el suyo pero el otro no, quedando un cromosoma con un fragmento de más (como consecuencia el fragmento quedará duplicado) y uno con un fragmento de menos (se producirá una deleción). Por último, otro mecanismo de producción, es que la duplicación puede aparecer en el paciente como consecuencia de una translocación parental entre cromosomas homólogos.
Aunque se han descrito muchas duplicaciones, como pueden afectar a diferentes fragmentos de los cromosomas, hasta el momento muy pocas han sido caracterizadas en profundidad. No obstante, hay ciertos fenotipos que parecen asociarse con duplicaciones de determinadas regiones cromosómicas (1).
En este estudio presentamos 5 casos de duplicación cromosómica, su repercusión fenotípica en los pacientes y la comparación de los fenotipos observados con casos similares referidos por otros autores.
2. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1 Pacientes
Estudiamos las duplicaciones cromosómicas encontradas en un estudio citogenético realizado a 10.478 pacientes, en la unidad de Citogenética del Departamento de Patología de la Facultat de Medicina i Odontología de la Universitat de Valencia. Las características clínicas de los pacientes quedan recogidas en la tabla 1.
Tabla 1
2.2 Cultivo de linfocitos de sangre periférica
El análisis citogenético, se realizó mediante el cultivo a corto plazo de linfocitos de sangre. Se extrajo sangre venosa del antebrazo en un tubo de heparina de litio. En cada tubo se sembraron 15 gotas de sangre completa con medio de cultivo: RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute) (Gibco BRL, Grand Island, NY) suplementado con 20% de suero bovino fetal (SBF), 200mM L-glutamina, 1% de antibióticos y 1% de fitohemaglutinina (Gibco BRL). Las células se incubaron a 37ºC durante 72 horas para luego proceder al sacrificio del cultivo para la extracción de cromosomas.
Para detener las células se añadió a cada tubo Colcemid 0.02 µg/mL (Gibco, BRL) y se incubó durante 75 min a 37ºC. Posteriormente, se sometió a las células a un choque hipotónico para hincharlas y permitir la separación de los cromosomas, mediante la incubación con 0.075 M de KCl a 37ºC durante 20 min. Seguidamente, se fijaron las células con varios lavados de solución de Carnoy (ácido acético/metanol, 1:4). Los tubos con los sedimentos celulares se conservaron en congelador a -20ºC, hasta su utilización. Por último, se realizaron las extensiones cromosómicas.
2.3 Bandas G (tripsina-Giemsa)
Se trataron las extensiones con una solución de Tripsina-EDTA 0.25% (Gibco, BRL) en PBS, y se tiñeron con colorante Giemsa al 10% en tampón McIlvaine a pH 6.8. Tras la observación microscópica, se contaron diversas metafases y se procedió a la elaboración del cariotipo. Para elaborar dicho cariotipo, se ordenaron entre 5 y 8 metafases y finalmente se formularon según la nomenclatura ISCN (4).
2.4 Bandas prometafásicas
Esta técnica se utilizó para obtener mayor número de bandas y poder determinar mejor los puntos de rotura. Se sembraron 0.3 mL de sangre en 5 mL de medio T-199 suplementado con 10% de SBF + 1% de antibióticos + 1% de L-Glutamina y 1.2% de fitohemaglutinina. Durante 48 horas se incubó a 37ºC y transcurrido este tiempo, se le añadió 0.1mL de solución de methotrexate (O.2mL de MTX, 25µg/mL, en 100mL de agua estéril) y se incubó durante 16 horas (7). Posteriormente, se cultivaron en 5 mL de medio completo y 0.1 mL de solución de timidina (24.22 mg de timidina + 100 mL de agua estéril). Tras 5 horas, se procedió al sacrificio de los cultivos y a la realización de las bandas G, tripsina-Giemsa.
2.5 Hibridación “in situ” por fluorescencia (FISH): pintado cromosómico
Para la realización del pintado cromosómico, las extensiones envejecidas 24 horas, fueron pretratadas en 2xSSC a pH:7 a 37ºC durante 2 min y deshidratadas con diluciones de etanol a concentración creciente. Se prepararon las sondas para ponerlas en contacto con las muestras y se incubaron a 37ºC durante 16 horas. Se realizó contratinción con DAPI. La observación se realizó en el microscopio de fluorescencia Zeiss Axioplan 2 (Carl Zeiss Meditec Iberia, Madrid, España). Las sondas utilizadas fueron: de pintado cromosómico: Spectrum Green (SG): WCP4SG, WCP8SG, y Spectrum Orange (SO): WCP7SO, WCP9SO, y WCP10SO (todas de Vysis). La sonda telomérica: ptel08P-R (QBiogene) y la sonda combinada MD 10p14 / SE10 para el cromosoma 10 (Kreatech)
3. RESULTADOS
3.1 Estudio citogenético
De los 10.478 pacientes a los que se realizó el estudio citogenético, 5 fueron portadores de duplicación cromosómica (0.048%). Los resultados citogenéticos (fórmula cromosómica y estudio familiar) y la patología asociada quedan recogidos en la tabla 2. En todos los casos se afectaron los autosomas (5/5). El 60% fueron mujeres y el 40% varones. En tres casos la duplicación fue directa y en tándem, y en dos de ellos el material genético duplicado estaba invertido. Todas las duplicaciones fueron de novo, excepto una de ellas, que fue heredada de la madre.
Tabla 2
Caso 1. Duplicación 4q. El estudio del paciente se solicitó por abortos espontáneos de repetición. El cariotipo con bandas G y prometafásicas mostró la presencia de una duplicación en el cromosoma 4 del fragmento comprendido entre q22 y q24 (fig. 2A). El estudio familiar reveló en la madre la misma anomalía.
Caso 2. Duplicación 7q. El estudio de la paciente se realizó a los 2 meses de edad y fue solicitado dada la presencia de orejas puntiagudas, hiperplasia cerebelosa y ventrículos dilatados. El cariotipo con bandas G presentó duplicación de material cromosómico en los brazos largos del cromosoma 7 (fig. 2B y 2F). El estudio familiar realizado mostró en ambos padres cariotipo normal, por lo que esta anomalía se produjo “de novo” en la paciente.
Caso 3. Duplicación 8p. El paciente para el que se solicitó el estudio fue un varón de 7 meses de edad con asimetría en miembro superior izquierdo y en los orificios nasales, así como implantación baja de los pabellones auriculares. El cariotipo del paciente presentó una anomalía estructural en el cromosoma 8, consistente en una duplicación invertida del fragmento comprendido entre p.11.2 y p23.1 (fig. 2C y 2F). Se produjo también la pérdida del telómero 8p, confirmada por la técnica de hibridación in situ por fluorescencia (FISH) mediante la sonda específica de esa región ptel08P-R. Con la utilización de la sonda de pintado completo, CP5608GW, el cromosoma anómalo hibridó en toda su longitud confirmando que todo el material correspondía al cromosoma 8. El estudio familiar reveló que la anomalía era de nueva aparición.
Caso 4. Duplicación 9q. La paciente fue remitida a los 15 meses de edad por retraso psicomotor y pondoestatural (peso y talla
Caso 5. Duplicación 10p Se solicita el análisis citogenético a la paciente de 6 años de edad. Presentaba retraso psicomotor, que afectaba especialmente al área de lenguaje y pie izquierdo con tendencia de desviación hacia adelante. La paciente había padecido episodios convulsivos febriles hasta los dos años, además de un episodio afebril aislado.
Para determinar con mayor precisión los puntos de rotura, se realizó la tinción de bandas G en placas prometafásicas, lo que estableció que el segmento duplicado afectaba a las bandas 13-15 de los brazos cortos de un cromosoma 10 (fig. 2E). Esta anomalía se confirmó por hibridación in situ por fluorescencia (FISH), con sonda de pintado cromosómico que confirma que todo el material del cromosoma corresponde al cromosoma 10, y mediante sonda del locus 10p14, encontrándose una doble señal para el sitio 10p14. El estudio familiar también muestra que la duplicación es de nueva aparición.
Figura 2
4. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
La incidencia de duplicaciones en el estudio realizado ha sido de un 0.48‰ sobre el total de cariotipos estudiados. Esta baja incidencia, que coincide con la referida por otros autores, hace que la duplicación cromosómica pertenezca a la categoría de enfermedades raras que, como es sabido, son de difícil caracterización y pronóstico. Además, hay que considerar que las duplicaciones, al igual que otras alteraciones estructurales de los cromosomas, pueden afectar desde fragmentos compuestos por un número pequeño de bases hasta grandes segmentos cromosómicos, lo que dará lugar a repercusiones fenotípicas muy variadas. De los casos que presentamos, sólo uno de ellos se encuadra en un síndrome determinado: se trata de la duplicación invertida y con deleción distal del brazo corto del cromosoma 8 (2), si bien el fenotipo presenta variaciones de unos niños a otros.
La duplicación 4q, con la afectación de fragmentos de distinto tamaño es un trastorno cromosómico muy poco frecuente que presenta clínica variable dependiendo del segmento duplicado (8). El peso al nacer suele ser bajo y las alteraciones craneofaciales más frecuentes son microcefalia, hipertelorismo, epicantus, fisuras palpebrales antimongoloides, puente nasal largo, cuello corto e implantación baja de los pabellones auriculares. La mitad de los pacientes presentan cardiopatías congénitas y un 30% manifiesta alteraciones genitourinarias.
Un hecho interesante es que, en un estudio previo, Zollino y cols. (7) refieren un paciente con duplicación de la región 4q22-23, región que está comprometida en nuestro primer caso. En nuestro caso, el paciente era un varón de 30 años sin anomalías fenotípicas relevantes en el que el estudio citogenético reveló una duplicación del segmento comprendido entre 4q22y q24. Este hecho resulta especialmente interesante porque estamos ante una duplicación (4q22-24) que no presenta alteración fenotípica, frente a otra de menor tamaño (4q22-23) en la que el paciente sí que presentó un fenotipo alterado. Una posible explicación a este fenotipo alterado sería la rotura de un gen localizado en 4q23 que se mantiene intacto (aunque duplicado) en nuestro caso, hecho que no implica la alteración del fenotipo de nuestro paciente. Además, en nuestro caso el paciente había heredado la anomalía de su madre, que tampoco presentaba alteraciones de interés.
Las duplicaciones del brazo largo del cromosoma 7 son muy raras y en los casos publicados tienen su origen en translocaciones parentales, por lo que al exceso de genes del cromosoma 7, se asocia la pérdida de genes de otros cromosomas, lo que complica el estudio fenotípico. Se han descrito alrededor de 54 casos de trisomía parcial 7q (8) y en la mayor parte de los casos de incluyen retrasos en el desarrollo, hipertelorismo, cabeza grande, frente prominente, cuello corto y pabellones auditivos de implantación baja. Por tanto, las manifestaciones fenotípicas de la paciente con cariotipo 46,XX,dup (7) (q36q34) consistentes en orejas puntiagudas, hiperplasia cerebelosa y ventrículos dilatados, siguen sin poder ser consideradas un síndrome concreto y por tanto, son de difícil diagnóstico al nacimiento.
Respecto a las duplicaciones cromosómicas invertidas, hay que señalar que son probablemente más frecuentes de lo que se pensaba hace 5-10 años. De hecho, muchas duplicaciones inicialmente interpretadas como directas en los métodos citogenéticos habituales, resultan estar invertidas cuando se estudian con procedimientos más sofisticados como el análisis molecular (2). En el caso de las duplicaciones invertidas en el brazo corto del cromosoma 8, las principales alteraciones fenotípicas que encontramos en la literatura (2) son retraso mental, trastornos del lenguaje y anomalías estructurales en el cerebro. La bibliografía consultada indica que en algunos casos, el origen de esta cromosomopatía puede ser consecuencia de un error que ocurre en la meiosis I materna, en madres heterocigotas para una inversión submicroscópica en el brazo corto del cromosoma 8. Además, Bonaglia y cols. (2) describen una duplicación invertida asociada con una deleción distal que coincide con nuestro tercer caso. En él, los pacientes presentaron en común anomalías a nivel de los pabellones auriculares.
Las duplicaciones del cromosoma 9, constituyen en algunos casos síndromes concretos, como es el caso del Síndrome trisomía 9p (9) o Síndrome de Rethoré. Las principales alteraciones fenotípicas son retraso psicomotor, malformaciones craneofaciales y anomalías de manos y pies. También se han publicado trisomías totales o parciales de este cromosoma (10). En nuestro caso, la paciente (una niña de 15 meses), presentó: microretrognatia, pie equino, estenosis del píloro y un retraso severo del lenguaje a los cuatro años, pero hay que tener en cuenta que, en este caso, la duplicación era de parte del material del brazo largo del cromosoma. No hemos encontrado descritos casos que impliquen exactamente al mismo segmento. Cabe destacar que Tiong et al. también hacen referencia a la estenosis pilórica en su paciente con trisomía parcial 9q (11). Existe además otro síndrome conocido como Síndrome de la duplicación 9q34 (12) que cursa con la implantación anómala del pulgar tal y como ocurría en nuestra paciente, que presentaba implantación baja de pulgares.
Por último, con respecto a la duplicación de parte del brazo corto del cromosoma 10 (p13p15), Voullaire y cols. (13) describen retraso psicomotor variable y del lenguaje en portadores de duplicación de la región 10p14 que se había transmitido por cuatro generaciones. La región 10p14, está incluida en el fragmento duplicado en nuestro paciente, una niña de 6 años que presentaba retraso psicomotor moderado.
En conclusión, los pacientes con duplicaciones cromosómicas presentan diversas alteraciones en el fenotipo, y en general retraso psicomotor. Además, el conocimiento y pronóstico de la enfermedad se ve dificultado ya que la duplicación cromosómica puede afectar a cualquier región del cromosoma y, por tanto, las posibles combinaciones que pueden darse en el genotipo alterado son múltiples y dificultan el análisis de los genes alterados y de sus repercusiones fenotípicas.
Por ello, es de gran importancia analizar las duplicaciones cromosómicas y su correlación con los fenotipos que presentan los pacientes a fin de conocer mejor estas patologías infrecuentes y poder realizar una terapia adecuada desde el nacimiento del niño con el objetivo de mejorar su calidad de vida. Así pues, el conocimiento de estas anomalías genéticas, la formación de asociaciones y grupos de ayuda a los enfermos y la inversión para la investigación de estas enfermedades raras, son un vehículo esencial para comprender mejor esta patología y su tratamiento, y mejorar así el día a día de pacientes y familiares con duplicación cromosómica.
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