Enriquecimiento de un inoculo de bacterias nitrificantes para ser empleado en el tratamiento de aguas residuales y evidenciando su crecimiento por medio de parámetros fisicoquímicos y bioquímicos

Olga de J, Ornelas, P. (1), Yassellis, J Ruiz, (2). Luis, F Medina, T, (2).

(1) Profesor Instructor. Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias de la Salud – Universidad de Carabobo, Venezuela
(2) Centro de Investigaciones Microbiológicas Aplicadas (CIMA) FCS – UC, Venezuela.

Resumen

La contaminación de los cuerpos de agua con compuestos de nitrógeno amoniacal derivados de las actividades humanas, es objeto de preocupación a nivel mundial y comprometen las reservas de agua aptas para consumo tanto humano como animal dado la elevada toxicidad de estas moléculas y las consecuencias que para la salud trae la falta del mencionado recurso. Las bacterias nitrificantes no crecen eficiente ni rápidamente en cultivos axénicos convencionales debido a su carácter autotrófico el cual determina sus exigencias nutricionales.

La presente investigación describe el comportamiento de 3 sistemas de enriquecimiento incubados por un periodo de 24 días para el desarrollo de bacterias nitrificantes numerados como I, II y III, de los cuales el sistema III fue suplementado con sales de amonio para facilitar la disponibilidad de moléculas alimenticias, a cada uno de los enriquecimientos se les inoculó con un consorcio comercial de bacterias nitrificantes constituido por especies de Nitrobacter, Nitrosomonas y Nitrospira, para poder evidenciar el comportamiento de este consorcio se determinó las concentraciones de nitrito como parámetro fisicoquímico, así como, se determinó la masa celular a través del tiempo, el sistema I no fue inoculado. Se obtuvieron incrementos de la concentración de nitritos en los sistemas II y III, aunadas al aumento de la masa celular a partir del día 24, estos valores comienzan a decrecer. La masa celular no varió en el sistema I a través del tiempo. Se necesita ampliar el protocolo aplicado para poder visualizar cambios significativos a través del tiempo.

Palabras clave: Nitrobacter, nitrificación, aguas residuales.

Enrichment of an inoculum of nitrifying bacteria to be used in the treatment of wastewater and demonstrate its growth through physical and chemical parameters and biochemistry.

Summary

The contamination of water bodies with nitrogen compounds from human activities is of concern worldwide and undertake suitable water supplies for human and animal consumption because of the high toxicity of these molecules and the implications for brings the lack of health of this appeal. Nitrifying bacteria do not grow quickly or efficiently because conventional axenic autotrophic character which determines their nutritional requirements.

This research describes the behavior of 3 sets of enrichment incubated for a period of 24 days for the development of nitrifying bacteria numbered I, II and III, which the system III was supplemented with ammonium salts to facilitate the availability of molecules food, each of the enrichments were inoculated with a commercial consortium made up of nitrifying bacteria Nitrobacter species, Nitrosomonas and Nitrospira, to demonstrate the behavior of this consortium was determined concentrations of nitrite as a physicochemical parameter and is determined cell mass over time, the system I was not inoculated. We obtained increases in nitrite concentration in systems II and III, coupled with the increased cell mass from day 24, these values start to decrease. The cell mass was unchanged in the I over time. It needs to extend the protocol applied to visualize significant changes over time.
Keywords: Nitrobacter, nitrification, wastewater.

INTRODUCCIÓN

La presencia de compuestos de Nitrógeno amoniacal y sus derivados en aquellos cuerpos de agua que reciben efluentes de actividades humanas, está ocasionando serios problemas desde el punto de vista ecológico dado que contribuyen al proceso de eutrofización de los cuerpos de agua receptores, provocando de esta manera una merma importante de las reservas de agua disponibles para su consumo, este tema se ha convertido en objeto de preocupación debido a la alta tasa de morbilidad y mortalidad anual atribuida a enfermedades causadas por la calidad y disponibilidad del agua potable, en especial en los países en vías de desarrollo.

Uno de los fenómenos más relevantes del desequilibrio de nitrógeno en los ecosistemas acuáticos es la eutrofización, la cual, acarrea múltiples problemas de repercusión en la salud a través del tiempo y trae como consecuencias el florecimiento de cantidades explosivas de plancton, la replicación de microorganismos resistentes a antimicrobianos, así como la depleción de los niveles de oxígeno disponibles para las especies que conviven en el ecosistema acuático comprometiendo la vida de las mismas, algunas actividades como la producción y uso de fertilizantes, fermentaciones con diversos propósitos, procesadoras de carne, industrias lácteas, refinerías de petróleo, actividades acuícolas, residenciales y otras , generan aguas residuales que contienen gran cantidad de nitrógeno y fósforo, de aquí la relevancia de implementar sistemas que favorezcan su adecuada remoción (Cervantes et al, 2000., Bertola et al, 2004).

Se han desarrollado diferentes alternativas para la remoción de las especies de Nitrógeno en los cuerpos que reciben aguas residuales, siendo los procesos biológicos de nitrificación bacteriana autotrófica los más eficientes y económicos, este proceso es llevado a cabo por un conjunto de especies bacterianas de la familia Nitrobacteriaceae la cual incluye como géneros representativos a Nitrosomonas spp, Nitrobacter spp y Nitrospira spp, que son microorganismos aerobios obligados no tienen la capacidad de desarrollarse en cultivos convencionales debido a sus requerimientos nutricionales especiales y que su velocidad de desarrollo es muy lenta.

El proceso de nitrificación biológica se da en 2 etapas: una primera etapa el amonio es oxidado a nitrito (NO2-) las bacterias del género Nitrosomonas y Nitrosococcus; en una segunda etapa, el nitrito es convertido a nitrato (NO3-) por las Bacterias Oxidantes del Nitrito, del género Nitrobacter y Nitrospira. Finalmente, el nitrato es reducido a nitrógeno gas, en un proceso anóxico llamado desnitrificacion, llevado a cabo por bacterias heterótrofas como las Pseudomonas, Achromobacter y otras, en el cual el nitrato es el aceptor de electrones (Avnimelech, 2009).

El carácter autotrófico de los géneros pertenecientes a la familia Nitrobacteriaceae, le otorga requerimientos nutricionales especiales basados fundamentalmente en la disponibilidad de una fuente de nitrógeno amoniacal, una fuente de carbono sencilla que les permita llevar a cabo la transformación de las moléculas nitrogenadas y un suministro constante de oxígeno, así mismo, la dificultad de las especies bacterianas mencionadas de crecer adecuadamente en cultivos axénicos convencionales complica su visualización directa y la cuantificación de sus colonias, todo esto aunado al lento crecimiento que poseen, crea la necesidad de desarrollar y probar sistemas de enriquecimiento alternativos que faciliten la utilización y potencien el efecto de las bacterias nitrificantes cuando son utilizadas para diferentes propósitos.

En la presente investigación se propone la descripción del comportamiento un consorcio de bacterias nitrificantes empleando medios líquidos enriquecidos en condiciones específicas para su crecimiento, visualizando este fenómeno a partir de la evolución de la concentración de nitritos y la masa celular en el tiempo en el medio empleado, como indicadores del crecimiento y su actividad bioquímica.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se empleó un consorcio comercial de bacterias nitrificantes en medio líquido previamente caracterizado que contiene Nitrosomonas. spp, Nitrospira. spp y Nitrobacter. spp., dicho consorcio se sometió a crecimiento en 2 medios de cultivo cuya evolución se siguió por un periodo de 24 días durante los cuales se ejecutaron mediciones de la concentración de Nitritos (parámetro fisicoquímico) y la determinación de la masa celular (parámetro bioquímico) en los días: 0, 3, 6, 9, 12, 21, 24, igualmente se siguió la evolución de un sistema sometido a las mismas condiciones y mediciones al cual se le denominó “control” y que no fue inoculado con el consorcio nitrificante. Cada sistema se dispuso en frascos estériles de vidrio de 4 Lt de capacidad con tapa de rosca, incorporándoles un sistema de aireación por manguera para garantizar suministro constante de oxígeno. Los 3 sistemas se incubaron a la temperatura ambiente del laboratorio (28 – 32 °C) ajustados a pH 8. Se empleó agua de laguna para todos los sistemas con la finalidad de reproducir las condiciones de crecimiento bacteriano en su hábitat natural.

Pre inóculo para bacterias nitrificantes

Se preparó con la finalidad de bioestimular al consorcio de bacterias nitrificantes previo a su incorporación a los sistemas de enriquecimiento y consiste en 500 mL de medio mínimo mineral al cual se le incorporó 1 mL del consorcio de bacterias nitrificantes, el medio mínimo mineral contiene 250 mL de solución de sales A con NaH2PO4H2O, K2HPO4 y NH4SO4 y 250 mL de solución de sales B con FeSO4 7 H2O, Mg SO4, ZnCl2 y CaCl2 diluidas en agua destilada estéril para un volumen final de 1 Lt de medio. Posteriormente se separaron 2 alícuotas de este pre inóculo dispensándolo en frascos estériles de vidrio con tapa de rosca para ser incorporados a los sistemas.

Sistemas de enriquecimiento para bacterias nitrificantes

Se instalaron 3 sistemas de reacción conteniendo las siguientes especificaciones: 

a) Sistema I: Contiene 3 Litros de agua de laguna esterilizada por filtración en membrana.

b) Sistema II: Contiene 3 Litros de agua de laguna esterilizada por filtración en membrana y 250 mL del pre inóculo del consorcio comercial de bacterias nitrificantes.

c) Sistema III: Contiene 3 Litros de agua de laguna esterilizada por filtración en membrana, enriquecida con 141.6 mg de Sulfato de Amonio [(NH4)2SO4], 26.4 mg de Fosfato Di básico de Potasio (K2HPO4) y 150 mg de Bicarbonato de Sodio (NaHCO3), de acuerdo a lo propuesto por Achuthan et al (2005), además 250 mL pre inóculo descrito anteriormente.

Determinación de Nitritos en los Sistemas de enriquecimiento

Se tomó un 30 mL de agua cada 72 horas en cada uno de los sistemas partiendo del tiempo “cero” del inóculo. La determinación de nitritos se realizó por la metodología colorimétrica comercial, empleando un espectrofotómetro HACH 2700, cada valor se dispuso en tablas de registro y se graficó para el análisis.

Determinación de masa celular

Para evidenciar el crecimiento celular dentro de los sistemas inoculados, se tomaron 100 mL de agua presente en cada sistema, se filtró empleando un sistema de bombeo al vacío con membranas de acetato de celulosa por separado, cada membrana se desecó por un periodo de 90 minutos y se pesó en una balanza analítica previo a la filtración para eliminar las trazas de humedad y determinar su peso inicial. Luego de la filtración se repitió el proceso de secado y pesada para obtener el peso final, la masa celular se calculó por diferencia de los pesos inicial y final dividiendo entre el volumen de muestra filtrada (100 mL).

Masa celular (mg/ml) = (Peso post - desecación (mg) – Peso predesecación) / Volumen de agua filtrado (100 mL)

Las mediciones y cálculos, fueron registradas a través de tablas y representadas en gráficos de curvas de progresión para nitritos y masa celular.

DISCUSIÓN Y RESULTADOS

Tabla 1: Concentración de Nitritos y masa celular en sistemas de enriquecimiento para bacterias nitrificantes