por punción de la vena umbilical, se realiza guiada por ultrasonido y tiene una mortalidad asociada al procedimiento de aproximadamente 2%. En la actualidad solo se utiliza para el estudio de alto riesgo de aneuploidia y en casos de anemia fetal como ocurre en la isoinmunización por factor Rh. No se utilizan en pacientes de bajo riesgo. (6)
MÉTODOS CITOGENÉTICOS:
Las muestras para análisis citogenético se obtienen de estudios de rutina en sangre periférica en cuyo caso se examinan los linfocitos T del líquido amniótico para el cultivo de amniocitos; de células trofoblásticas proveniente de vellosidades coriónicas; de medula ósea; de fibroblastos cultivados, que por lo general se obtienen de una biopsia cutánea. Deben cultivarse suficiente células para que la oportunidad de detectar una línea celular citogenética distinta (mosaicismo) sea alta desde el punto de vista estadístico. En la mayor parte de las situaciones clínicas se examinan y se cuentan 20 mitosis bajo visualización microscópica directa, y 2 se fotografían y preparan para el cariotipo. (1)
Cariotipo: La citogenética es el estudio de los cromosomas por microscopia de luz. La constitución cromosómica de una sola célula o de todo el individuo se especifica por medio de anotaciones estandarizadas. Primero se determina el recuento total de cromosomas, después el complemento de cromosomas sexuales y por ultimo cualquier anomalía. Los autosomas se designan del 1 al 22, los signos (+) o (-) indican ganancia o pérdida del material cromosómico, respectivamente. Por ejemplo en el Síndrome de Down causado por trisomía 21 es 47, XX,+21; un niño con este trastorno causado por translocación del cromosoma 21 al 14 en un espermatozoide o un ovulo es 46, XY,-14,+t(14;21).
El estudio de los cariotipos es posible debido a la tinción. Usualmente un colorante adecuado es aplicado después que las células han sido detenidas durante la división celular mediante una solución de Colchicina. Algunas veces las observaciones pueden ser realizadas cuando las células no se están dividiendo (interfase). El sexo de un neonato feto puede ser determinado por observación de células en la interfase. De acuerdo a su tinción el cariotipo se clasifica en: (7)
- Cariotipo clásico, se suele utilizar una solución de Giemsa como tinción (específica para los grupos fosfato del ADN) para colorear las bandas de los cromosomas (Bandas-G), menos frecuente es el uso del colorante Quinacridina (se une a las regiones ricas en Adenosina-Timina). Cada cromosoma tiene un patrón característico de banda que ayuda a identificarla.
- Cariotipo espectral, el análisis espectral de los cariotipos (o SKY) se trata de una tecnología de citogenética molecular que permite el estudio y visualización de los 23 pares de cromosomas en forma simultánea. Sondas marcadas fluorescentemente son hechas para cada cromosoma al marcar DNA específico de cada cromosoma con diferentes fluoróforos. Debido a que hay un limitado número de fluoróforos espectralmente distintos, un método de etiquetado combinatorio es usado para generar muchos colores diferentes. La diferencia espectral generada por el etiquetado combinatorio son capturadas y analizadas usando un interferómetro agregado a un microscopio de fluorescencia. El programa de procesamiento de imágenes entonces asigna un pseudocolor a cada combinación espectralmente diferente, permitiendo la visualización de cromosomas coloreados. Esta técnica es usada para identificar aberraciones estructurales cromosómicas en células cancerígenas y otras patologías cuando el bandeo con Giemsa u otras técnicas no son lo suficientemente precisas. no son suficientemente seguras. Esta técnica es usada para identificar aberraciones estructurales cromosómicas en células cancerígenas y otras patologías cuando el bandeo con Giemsa u otras técnicas no son lo suficientemente precisas. no son suficientemente seguras.
Cariotipo digital, el cariotipo digital es una técnica utilizada para cuantificar el número de copias de ADN en una escala genómica. Se trata de secuencias de
- locus de ADN específicos de todo el genoma que son aisladas y enumeradas. Este método es también conocido como cariotipado virtual. (7)
El conteo cromosómico es necesario disponer de alguna célula fetal. La técnica más frecuentemente utilizada para la obtención de material genético fetal es la Amniocentesis, Biopsia de vellosidades coriónicas y cordocentesis. El acceso al material celular embrionario puede suponer un cierto riesgo, tanto para la madre como para el feto, por lo que su indicación se circunscribe a aquellos embarazos en los que se haya detectado un riesgo de aparición de la trisomía superior al de la población general.
Biología molecular: FISH o hibridación fluorescente in situ es una técnica de marcado de cromosomas en la que se provoca que los cromosomas específicos brillen bajo el microscopio. Esta técnica permite la rápida determinación de aneuploidia, la ausencia del cromosoma completo o la presencia de un cromosoma adicional, así como la adjudicación de un marcador genético a un cromosoma (cartografía genética). (8)
Los cromosomas que son usualmente utilizados con FISH son los 13, 18, 21, X e Y; sin embargo, como son posibles marcados adicionales del cromosoma, otros cromosomas pueden ser visualizados con esta técnica. FISH usa segmentos de una única hebra de ADN que son tintados, o etiquetados, con una sustancia fluorescente que puede ligarse a un cromosoma específico; estos segmentos de ADN son llamados sondas.
El primer paso de la técnica consiste en la desnaturalización del DNA para separar la doble hélice. A la muestra desnaturalizada se le añade entonces la sonda de interés (fragmento de ADN marcado fluorescentemente). Primero, las sondas hibridan a regiones específicas. Después, se tiñen los núcleos con un color de contraste inespecífico (generalmente DAPI). Las sondas de DNA pueden marcarse con moléculas fluorescentes (método directo) o no fluorescentes que se detectan con anticuerpos fluorescentes (método indirecto). (8)
La técnica FISH puede realizarse a los cromosomas en metafase o en interfase. En metafase se utiliza para detectar microdeleciones específicas, translocaciones o para identificar material extra de origen desconocido. Los tipos de sondas usadas son cósmidos, satélites alfas y sondas completas (painting probes). Los cósmidos son secuencias únicas que hibridan con fragmentos pequeños. Se emplean