Preparación de la simvastatina

La solución de simvastatina se preparó a una concentración de 3 x 10-6 M, tal como lo sugiere Álvarez de Sotomayor y col., (2001). Para ello se pesó 12,5 mg de polvo de simvastatina calidad reactivo, se disolvió en alcohol etílico 95% hasta completar 1 mL de solución. Se le agregó 0,15 mL de NaOH 0,1 eq/L y se colocó a 55 °C en baño de María por 2 horas, se disolvió en 500 mL de agua destilada, para obtener una solución a la Molaridad requerida (3 x 10-6 mol/L). Posteriormente se tituló la solución a pH 7 con solución de Cl.

Contracción del anillo traqueal

Las ratas se anestesiaron con tiobarbital sódico 60 mg/Kg i.p. Luego que se verificó la ausencia de reflejos nociceptivos se le extrajeron de 9 a 10 mm de tráquea, la cual se lavó y sumergió en una solución de Krebbs Ringer Bicarbonato (NaCl 125 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1mM, CaCl2 1.4 mM, H2PO4 1 mM, Lactato 28 mEq, HEPES 25 mM, pH 7.4) a una temperatura de 37º C y se aireó con una mezcla de aire. La preparación de la tráquea se equilibró por 30 minutos y el baño del tejido se remplazó continuamente con solución fresca temperada y aireada a un flujo de 1 mL/min. Seguidamente se cortó, con ayuda de una tijera quirúrgica, un anillo del segmento cervical traqueal del extenso de tráquea de 9 a 10 mm mencionados anteriormente, que contenía un total de aproximadamente de 12 anillos. El anillo traqueal se superfundió con Krebbs Ringer Bicarbonato por 30 minutos a 37 Cº, luego se agregó acetilcolina hasta lograr una concentración final de 10-3 M incubándose por 5 minutos a 37 °C. Luego, se lavó y estabilizó con solución fisiológica 0,9% temperada a 37 °C, se superfundió con agua fría (18 C°) por 5 minutos; nuevamente se lavó y estabilizó con solución fisiológica 0,9% y se agregó la solución de simvastatina 3 x 10-6 M, incubándose por 20 minutos a 37 °C (Escobales y col., 1996). Posteriormente, se superfundió durante 5 minutos a 37 °C con acetilcolina a una concentración final de 10-3 M, se lavó y estabilizó con solución fisiológica 0,9%, se incubó nuevamente con simvastatina 3 x 10-6 M por 20 minutos a 37 °C y se adicionó agua fría (18 C°) superfundiéndose por 5 minutos. El nivel de contracción de la tráquea fue medido en cada una de las soluciones de incubación. El mismo procedimiento se utilizó para la tráquea sin epitelio.

Todo el protocolo experimental empleado para evaluar el fenómeno de la contracción se filmó con una cámara digital de Video Sony DCR HC 30. Las imágenes se digitalizaron en una computadora con capturadora de Video, con una resolución de 256 MB. El procesamiento de las imágenes se realizó mediante un software analizador de imágenes, Image Tool, ® V. 3.0 (UTHSCSA). (Figura 1).

Este software analizador de imágenes nos permitió medir los cambios en la longitud del diámetro de los anillos traqueales con respecto al diámetro basal, que fueron registrados durante la secuencia de filmación de la muestra (Figura 2). La calibración utilizada como patrón de medida, se realizó midiendo con un vernier el diámetro de una cánula el cual fue de 0,8 mm.

Figura 2. Arreglo experimental para captura de imagen del anillo traqueal. A) Recipiente donde se almacena las soluciones para ser administrada al baño donde se encuentra el anillo traqueal. B) Manguera por donde se suministra el flujo de de solución. C) Baño donde reposa el anillo traqueal. D) Manguera de salida de solución. E) Cámara digital de video. F) Computadora con capturadora de video 256 MB de resolución y software analizador de imágenes, Image Tool, ® V. 3.0 (UTHSCSA)

Figura 3. Longitud del diámetro de los anillos traqueales analizados en Image Tool, ® 3.0 (UTHSCSA). Las seis figuras mostradas a la izquierda (A) muestran los anillos traqueales con epitelio y las seis figuras mostradas a la derecha (B) muestran los anillos traqueales sin epitelio. A todas se les aplicó el mismo protocolo experimental: a) anillo en condición basal, normal. b) anillo incubado con acetilcolina. c) anillo incubado con agua fría. d) anillo incubado con simvastatina e) anillo incubado con simvastatina + acetilcolina. f) anillo incubado con simvastatina + agua fría.

Extracción del Epitelio traqueal

La extracción del epitelio se realizó en base a la técnica estandarizada por González y Santacana (2000). Una vez extraído los 9 a 10 mm de tráquea de la rata de experimentación, se cortó un segmento de 4 a 5 mm, con ayuda de una tijera quirúrgica. Luego se introdujo un aplicador con punta de algodón dentro del orificio de la superficie luminal traqueal de manera de poder remover con un suave roce el epitelio. Al final del experimento la tráquea se preservó en formol al 10% y se procedió al procesamiento mediante técnicas histológicas tiñendo con hematoxilina y eosina. Se observaron al microscopio y se evidenció la ausencia del epitelio lo que permitió controlar que el procedimiento de extracción fue exitoso.

Análisis estadístico

Se analizaron los datos con un paquete estadístico, aplicando pruebas no paramétricas de Wilcoxon.

RESULTADOS

En la tabla 1, se presentan las mediciones de diámetros de los anillos traqueales en las distintas condiciones experimentales.