Por lo anteriormente expuesto, resulta lógico considerar al óxido nítrico como un elemento importante implicado en la etiopatogenia de la preeclampsia, donde cualquier desequilibrio en las moléculas vasorreguladoras puede jugar un papel importante. Se han realizados diversos estudios en los cuales se mide los niveles de los metabolitos de óxido nítrico (NO₂ y NO₃) en suero, plasma u orina de pacientes embarazadas sanas y preeclámpticas, sin embargo los datos aportados por estos son controversiales (10,15).

Ranta y col. en 1999 estudiaron las muestras plasmáticas y urinarias de 20 mujeres preeclámpticas, y encontraron niveles de óxido nítrico significativamente mayores a los observados en mujeres embarazadas sanas (n=21) (15). Posteriormente, en 2004, Hatice Paşaoğlu y col. realizaron un trabajo similar con un grupo de 40 preeclámpticas, 25 eclámpticas y 31 embarazadas sanas, demostrando niveles plasmáticos de óxido nítrico mayores en las mujeres eclámpticas; pero no así en las preeclámpticas, donde las concentraciones de óxido nítrico no mostraron diferencia estadística con respecto a las embarazadas sanas (10). Por otra parte otros autores también afirman que no existe diferencia alguna en los niveles de óxido nítrico de mujeres preeclámpticas y mujeres embarazadas, como es el caso de Conrad y col. En 1999 (16) y Diejomaoh F. y col. En 2004 (17).

A pesar de esto son cada vez más los autores que hablan a favor de que lo que realmente podría explicar parte de las alteraciones que ocurren en la preeclampsia sería una disminución en la producción de óxido nítrico, con lo que habría una pérdida de un importante estímulo vasodilatador (11). De hecho existen publicaciones que sustentan esta teoría; en 1994, Seligman SP y col; Jong Weon Choi en el 2002, entre otros., reportaron haber encontrado niveles circulantes en sangre de óxido nítrico disminuidos en mujeres preeclámpticas (18,19). Posteriormente surgieron estudios que tomaron en cuenta otras variables como el realizado por Mutlu-Turkoglu y col. en el año 1999 quienes midieron los niveles plasmáticos de peróxidos lipídicos junto con los de óxido nítrico en preeclámpticas, encontrando, en éstas, bajos niveles de óxido nítrico y altos de peróxidos lipídicos (20). En el 2002 se realizó en Venezuela un estudio similar, en la ciudad de Maracaibo, conducido por el Dr. Eduardo Reyna-Villasmil, obteniendo también altos valores de peróxidos lipídicos y bajos de óxido nítrico en el plasma de las embarazadas preeclámpticas. En ambos estudios se llegó a la conclusión que posiblemente los altos niveles de este tipo de radicales libres puede ocasionar un estrés oxidativo sobre la célula endotelial lo que explicaría la disminución de producción de óxido nítrico (20, 21).

El presente estudio tiene como objetivo determinar los valores séricos de óxido nítrico a través de sus metabolitos en sangre, nitrito (NO2) y nitrato (NO3), en un grupo de embarazadas con preeclampsia, debido a la gran controversia que existe entre los resultados obtenidos en los diferentes estudios y a limitada información al respecto en nuestra población. También se midió la misma variable en un grupo de embarazadas sanas (embarazo normal a término) y en uno de mujeres no gestantes sanas, que sirvieron como control.

Metodología

Todas las participantes, firmaron un consentimiento escrito. La población estuvo representada por mujeres embarazadas que acudieron al Servicio de Maternidad C.H.E.T. durante el período Agosto 2006-Mayo 2007. La muestra estuvo conformada por 36 pacientes embarazadas, con edad entre de 13-39 años y con edades gestacionales que variaban de 37-41 semanas (embarazos a término). 18 pacientes con embarazo normal a término y 18 con diagnóstico clínico-biológico de preeclampsia; basados en los criterios de diagnostico descritos en introducción. El grupo control estuvo conformado 18 por mujeres no gestantes sanas.

Las pacientes con preeclampsia, seleccionadas, no recibían tratamiento médico alguno para el control de la hipertensión arterial para el momento de la toma de las muestras. Pacientes con historia médica de HTA crónica, diabetes, insuficiencia renal, o cualquier otro tipo de enfermedad crónica, no se consideraron para el estudio.

Determinación de Óxido nítrico (NO), reacción de Griess

La muestra de sangre fue obtenida por venopunción, antes del comienzo del trabajo de parto y no se trató con ningún aditivo, de manera de obtener, una vez centrifugada la muestra, aproximadamente 3-4 ml de suero, el cual se colocó en tubos Eppendorf (1.5 ml) en dos alícuotas, para luego almacenarlos a –70 °C, hasta el momento de la determinación del óxido nítrico, por medio de la prueba de Griess. Esta prueba se fundamenta en la detección colorimétrica de los metabolitos del óxido nítrico (NO2 y NO3), que constituyen un marcador de la cantidad de óxido nítrico presente en la sangre y se pueden determinar con facilidad por su reacción con el reactivo de Griess (1% Sulfanilamida/0.1% Nafiletileno diamina dihidrocloridro/2.5% H2PO4) (22). El NO3 se mide después de la conversión enzimática de éste a NO2, por acción de la nitrato reductasa. Para ello, se colocaron las muestras, por triplicado, y se diluyeron 1:4 en H2O bidestilada, luego se incubaron durante 20 minutos a 37°C con 5uM de FAD (Dinucleótido de Adenina y Flavina), 50 uM de NADPH (dinucleótido de Adenina y Nicotilamida Fosfato y 200 U/L de nitrato reductasa.

Posteriormente, se agregó 0,001 g/ml de Lactato Deshidrogenada y 10 mM de Piruvato de sodio y se incubaron durante 5 minutos. El montaje de esta técnica se hizo en placas ELISA de 96 pocillos y fondo plano (Falcon, Becton Dickinson and Company), donde se incluyó por réplicas un blanco y un patrón de nitrito de sodio (500 mM) en tampón fosfato de pH=7,5 (15 uM K2 HPO4, 31 uM KH2PO4 [6:1]). A cada pocillo, se agregó 50 ul del sobrenadante de la muestra y 150 ul de reactivo de Griess y se incubó, en oscuridad, durante 10 minutos, y posteriormente, se midió su absorbancia a una densidad óptica de 595 nm en un lector de placas. Las densidades ópticas se evaluaron automáticamente por el lector de ELISA, según la curva de calibración preparada para este experimento. La concentración de óxido nítrico, así determinada, fue proporcional a la concentración de nitritos y nitratos presentes en las muestras (NO2-/NO3-).

Los resultados de las concentraciones séricas de óxido nítrico fueron expresados en su media ± desviación estándar. Se aplicó la prueba de Kolmogorov-Smirnov para determinar el tipo de distribución de los datos y como ésta fue normal se aplicó la prueba T Student, para comparar las medias entre los grupos de estudio. Todos los cálculos y gráficos se realizaron con el programa Statistica versión 5.0.

Resultados

El promedio de las concentraciones séricas de óxido nítrico, en el grupo embarazo normal a término, fue de 103,6±22,4 uM; mientras que, en el grupo preeclampsia, fue .de 86,2±10,3 uM. Además, se observa que, en el grupo de no gestantes, la concentración de óxido nítrico fue de 31,9±5,5 uM. (Fig 1)

Cuando se comparan ambos grupos de estudio, con el grupo control de pacientes no gestantes, se observa que, el promedio de las concentraciones séricas de óxido nítrico tanto en preeclampsia como en el grupo de embarazo normal a término, fueron significativamente mayores que el promedio de las concentraciones observadas en el grupo no gestantes. (Embarazo normal a término: 103,6±22,4 uM vs.31,9±5,54 uM; preeclampsia 86,2±10,3 uM vs. 31,9±5,5 uM. P<0,05).

Al comparar el grupo embarazo normal a término, con el grupo de pacientes con preeclampsia, se observa que, el promedio de las concentraciones séricas de óxido nítrico, en el grupo embarazo normal a término, fue significativamente mayor que el observado en el grupo preeclampsia (103,6±22,4 uM vs. 86,2±10,3 uM. P<0,05)

Discusión

La fisiopatología de la preeclampsia es desconocida, sin embargo, se sabe que existe una serie de cambios que incluyen aumento de la sensibilidad a los vasoconstrictores, de la permeabilidad vascular y de la coagulación plasmática, por lo que muchos autores sugieren que existe una alteración endotelial (11, 13). Diversos estudios se han abocado a este aspecto y, actualmente, se investiga acerca del papel que tiene el óxido nítrico en esta patología ya que es el principal vasodilatador liberado por el endotelio (8, 10-13, 15-17, 19, 20).

Nuestros resultados muestran que las concentraciones de óxido nítrico son significativamente mayores en embarazo normal a término que en mujeres no gestantes (Fig. 1). Estudios previos (23) donde se determinan las concentraciones séricas de óxido nítrico, durante el embarazo, muestran que las mismas aumentan de manera significativa durante el último trimestre. Sin embargo, otros estudios que comparan las concentraciones de óxido nítrico en embarazadas sanas y mujeres no embarazadas reportan resultados controversiales. Así, por ejemplo, Milena y col. (24) y Conrad y col. (16) no reportan diferencias significativas en los niveles de óxido nítrico entre ambos grupos. No obstante, es de hacer notar que en el trabajo del grupo de Milena y col. se tomó la muestra de las embarazadas sanas después de la interrupción del embarazo y en el trabajo de Conrad y col. se hicieron las determinaciones en plasma humano, mientras que en nuestro trabajo, las determinaciones se hicieron antes del parto o cesárea y fueron medidas en suero.

Por su parte, otro equipo de trabajo (23) reporta resultados muy similares a los nuestros. Esto nos permite sugerir que el incremento de los valores séricos de óxido nítrico es importante en el mantenimiento y desarrollo del embarazo.

Las concentraciones de óxido nítrico, fueron significativamente menores (P<0.05) en pacientes con preeclampsia (Fig. 1). Resultados contradictorios son reportados en la literatura científica, ya que algunos reportes (10, 16) muestran niveles séricos de óxido nítrico similares en estos dos grupos. Otros grupos reportan que dichas concentraciones son significativamente mayores en mujeres con preeclampsia (15), mientras que otros reportan resultados similares a los nuestros (21, 23, 25-29). Es posible que una variabilidad en la desproteinización de la muestra determine este tipo de resultados tan disímiles debido a que las proteínas representan una de las principales fuentes de nitritos y nitratos, metabolitos que en la reacción de Griess, representan de manera indirecta, los niveles de óxido nítrico. En consecuencia, es posible que los valores reportados por esos grupos de trabajo estén sobre estimados debido a la presencia de un exceso de proteínas en la muestra, ya que todas esas determinaciones se realizaron en plasma humano.