Materiales y métodos

 

Se trabajó con muestras de pacientes con lesiones orales pre-malignas y malignas (n=57) clasificados según el grado anatomopatológico, e individuos con lesiones orales benignas (n=93). También se analizó una población de individuos sin patología demostrable (n=81) Todos los pacientes estudiados fueron derivados de la Cátedra de Estomatología de la Universidad Nacional de Rosario, con consentimiento informado previo.

 

Los antígenos ABH en células de cortes histológicos de pacientes con lesiones orales pre-malignas y malignas fueron estudiados por la técnica de inmunoadherencia (10). Las lesiones benignas fueron analizadas por la misma técnica. Se obtuvo muestra de mucosa yugal de los pacientes que fueron considerados controles normales. Se utilizó la técnica de inhibición de la aglutinación para detectar la presencia de antígenos solubles de grupo sanguíneo ABO.

 

Células de mucosa yugal: Se obtuvieron por raspado de la cavidad interna de la boca y colectadas en tubo con 1mL de solución salina. Las mismas fueron sometidas a sucesivos choques térmicos (3 veces). Se centrifugaron las muestras y se trabajó con el sobrenadante.

 

Técnica de inhibición de la aglutinación: (11)

 

Se realizaron 3 baterías de diluciones geométricas al medio, del material en estudio (células de mucosa yugal) en Buffer Fosfato Salino (PBS) pH 7,4. Se enfrentó cada batería con igual volumen de antisueros de distinta especificidad: anti-A, anti-B y lectina Ulex europeus, convenientemente diluidos. Los tubos se incubaron 10 minutos a temperatura ambiente y se revelaron con una suspensión de glóbulos rojos isogrupo al 5% en PBS. Se centrifugó a 1000 RPM durante 1 minuto y se observó aglutinación macroscópica. Con esta técnica se evalúa en forma indirecta la presencia de antígenos ABH solubles.

 

Técnica de inmunoadherencia (10)

 

Las muestras de tejido proveniente de las lesiones orales pre-malignas y malignas (n=57) conservadas en taco de parafina fueron sometidas a cortes con micrótomo, de manera de obtener secciones de 4 mm de espesor, y posteriormente fueron adheridos sobre un portaobjetos. Luego se desparafinaron por cambios en solvente xilol y alcohol, se colorearon con hematoxilina y lavaron con buffer Tris-salina isotónico pH7,4 durante cinco minutos eliminando el exceso de buffer.

 

Las secciones fueron cubiertas durante diez minutos, a temperatura ambiente, con antisuero monoclonal anti-A, anti-B o lectina anti-H (Ulex europeus), en concentración óptima de acuerdo al grupo sanguíneo específico del paciente. Los portaobjetos colocados en un vaso de Coplic se incubaron 3 veces con buffer Tris durante 15 minutos para eliminar el antisuero o la lectina anti-H en exceso. Cada sección fue cubierta con una suspensión de eritrocitos isogrupo al corte en estudio al 5% en PBS, durante 15 minutos. Los glóbulos rojos pueden adherirse a la sección de tejido, desparafinado vía antisuero o lectina.

 

Posteriormente, se colocaron los preparados invertidos, sobre dos barras soporte, en una caja de Petri conteniendo buffer Tris, para que los eritrocitos estén en contacto con la solución buffer, lo cual permite eliminar los eritrocitos no adheridos. Se incubó durante 30 minutos y se observaron microscópicamente. Se utilizaron como controles positivos el tejido vascular y como controles negativos el tejido adiposo.

 

Interpretación:

 

Los resultados fueron semicuantificados desde adherencia fuertemente positiva (++++) a adherencia negativa (-) de acuerdo al porcentaje de células del tejido en estudio con hematíes adheridos. Se utilizaron para designar niveles intermedios de adherencia: + equivalente al 25% de adherencia, ++ a 50% y +++ a 75%.

 

Análisis estadístico

 

Se aplicó el test de chi cuadrado para el análisis de posibles asociaciones entre las variables predictivas y de impacto en el estudio. Se calcularon razones de Odds y se estimaron los intervalos de confianza.

 

Resultados

 

Los datos obtenidos de la expresión ABH en muestras de tejidos de lesiones orales se presentan en la tabla 1. Se observa una asociación significativa entre deleción de los antígenos ABH en muestras de lesiones orales y grado de malignidad de las lesiones orales (p Yates= 0,005). Las lesiones analizadas  de precáncer y cáncer oral mostraron una deleción del 89,4% en las muestras analizadas, mientras que el 10,6% conservó la expresión antigénica ABH.  En las lesiones benignas diagnosticadas anatomopatológicamente, el 38,7% de las mismas presentaron una pérdida de la reactividad antigénica y el 61,3% restante conservó su expresión.

Al analizar la presencia de antígenos ABH en muestras de mucosa yugal por la técnica de inhibición de la hemaglutinación en los 81 pacientes sin patología demostrable (controles normales) se observó que todas (100%) conservaban su reactividad.

 

Discusión

 

Los glucoconjugados de membrana de las células epiteliales presentan carbohidratos antigénicos relacionados con las sustancias de grupo sanguíneo. Durante la progresión a la malignidad, estos oligosacáridos inmunodominantes sufren alteraciones específicas. El cambio más frecuente y destacable en las determinantes de grupo sanguíneo asociado con cáncer humano es la deleción de antígenos de grupos sanguíneos A, B o H (6,7).

 

En el diagnóstico histopatológico de rutina, la clasificación del tipo de tumor está basado en la apariencia histológica de la mayoría de las partes diferenciadas del tumor. Por otro lado, el pronóstico de la enfermedad está basado parcialmente en el grado de diferenciación del tejido. En la mayoría de los casos el grado de diferenciación está determinado por la morfología celular del tejido analizado y por la capacidad de las células de sintetizar productos específicos tales como queratina y mucina. Previamente ha sido demostrado que la expresión  de los carbohidratos sobre la superficie celular de epitelio estratificado está relacionado a la diferenciación celular (12; 13)

 

En el presente trabajo, hemos utilizado la pérdida de la expresión de los antígenos ABH como marcador de diferenciación celular. Como la expresión de estos antígenos puede ser detectada a través de anticuerpos monoclonales, constituye un marcador de diferenciación más comúnmente utilizado en ensayos histológicos subjetivos. Se acepta que los tumores están compuestos por poblaciones celulares heterogéneas con distinto comportamiento biológico. Para obtener una óptima información del pronóstico sobre el tumor, se debería estudiar todas las subpoblaciones celulares. Si la biopsia recogida no es representativa del tumor, el estudio de la reactividad ABH puede ser relacionado con el grado del tumor en estudio. Esto podría ser valor diagnóstico y pronóstico de la patología en estudio. Estudios similares de deleción de antígenos ABH en cáncer de vejiga mostraron una asociación con peor pronóstico de la enfermedad. (14,15 y 16)