Las técnicas genéticas que más se han utilizado han sido:

Sondas ADN

Se ha preconizado el uso de sondas de ADN comerciales para el estudio de la sensibilidad de cepas de Mycobacterium tuberculosis a H (Isoniacida) y R (Rifampicina). La sensibilidad y especificidad para detectar las cepas resistentes a H y R son del 96% y 100% a los 5 días de incubación.

Actualmente se intenta poner a punto técnicas que permitan conocer precozmente la resistencia a los distintos fármacos a partir de la detección (directamente de la muestra clínica, o del cultivo) de las mutaciones puntuales responsables de los genotipos resistentes. Esto requiere un amplio conocimiento de las dianas genéticas implicadas en los mecanismos de resistencia.

Polimorfismo de la conformación de cadena simple (SSCP)

Se ha propuesto la realización del estudio de la resistencia a partir de cultivo, centrándose en cuatro dianas: katG, inhA, y ahpC para H, y rpoB para R.

La metodología utilizada se basa en el empleo de la técnica de polimorfismo de la conformación de cadena simple (SSCP), que permite la detección de una única mutación en una región de ADN monocatenario, a partir de su estructura secundaria alterada respecto del ADN monocatenario de cepas salvajes.

En la actualidad este método se puede estandarizar y podría ser asumible en laboratorios con la infraestructura necesaria.

Hibridación en fase sólida INNO-LipA

De los métodos basados en procedimientos genéticos aparecidos en los últimos años destaca el kit de hibridación en fase sólida INNO-LipA, de Innogenetic, que puede detectar más del 80% de las mutaciones responsables de la resistencia a R en el gen rpoB. El sistema utiliza tiras de nitrocelulosa que llevan incorporadas una serie de sondas que, al hibridar con el amplificado, cumplen dos funciones: 1) verifican la identificación de la cepa como perteneciente al complejo Mycobacterium tuberculosis, y 2) cubren la totalidad del gen rpoB, informando sobre la existencia de hasta el 86% del total de mutaciones responsables de la resistencia a R. La técnica puede realizarse directamente de la muestra clínica o de cultivo, y presenta una excelente correlación con los métodos tradicionales. Es un método rápido que, ante una resistencia a R, permite sospechar que la cepa puede ser multi resistente, ya que el 90% de las cepas resistentes a R lo son también a H.

Pruebas serológicas. (29-31)

Demuestra una sensibilidad del 60% y una especificidad de 88% ambas inferiores a la baciloscopia.
El enzimo – imunoanálisis (ELISA), parece ser desde el punto de vista técnico el que ofrece mayor perspectiva en la actualidad al ser una técnica rápida, automatizable y muy útil en situaciones clínicas como tuberculosis extrapulmonar (meningitis tuberculosa). Este método reduce a 12 días el tiempo necesario para detectar el Mycobacterium tuberculosis.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Es un método relativamente barato y puede realizarse masivamente. La ampliación enzimática del ADN, mediante PCR, permite sintetizar por vía enzimática millones de copias de un fragmento específico de ADN, se emplea en formas paucibacilares de la enfermedad (líquido pleural, líquido cefalorraquídeo, peritoneal, sinovial, pericárdico, así como orina, esputo y lavado broncoalveolar).

Es un método que puede detectar una cantidad pequeña como 10 a 100 bacterias de una muestra de esputo en un tiempo de 24 horas. Tiene una especificidad de 100%. (27)

Diagnóstico anatomopatológico. (1,32)

Demuestra la presencia de granulomas (caseoso) tuberculosis en biopsias obtenidas en diferentes órganos (bronquial, pulmonar, hepática, ganglionar, de médula ósea y otros).
Generalmente para identificar bacilos ácido alcohol resistente, se utilizan tinción Kinyoun.
Cuando el médico tiene alta sospecha de la presencia de una tuberculosis en este caso se realiza en microbiología un cultivo de la pieza por métodos tradicionales.

Novedosas tecnologías.

Un nuevo análisis de sangre basado en la inmunidad creada por el interferon gamma, (IGRA) con antígenos específicos para el Mycobacterium tuberculosis, el cual puede ser usado también para el cribado de la tuberculosis latente, al ofrecer ciertas ventajas sobre la técnica de PPD. Las pruebas actualmente disponibles incluyen el QuantiFERON-TB en tubo de Oro (QFT-GIT), una prueba que utiliza la técnica de ELISA, basado en los antígenos ESAT-6, CFP-10, y TB 7.7 y el T-SPOT.TB. El uso de una enzima unida al immunospot (ELISpot) basado en los antígenos ESAT-6 y CFP-10, presentan una altas especificidad y sensibilidad. Ambas pruebas miden la respuesta in vitro de las células T productoras de Interferon gamma, en respuesta a antígenos altamente específicos para el M. tuberculoso, aparte de la vacunación con BGG o la infección por M. avium. (32)

Jafari et al (32) encontró que el ensayo de ELISpot específico para el Mycobacterium tuberculosis puede usarse para diferenciar los casos de tuberculosis con esputo negativo, (BAAR) con los casos de infección latente de tuberculosis. En un estudio de 347 pacientes con sospecha de tuberculosis activa, incapaces de producir esputos o con BAAR negativo, la prueba de ELISpot con lavado broncoalveolar mostró una sensibilidad y especificidad de 91% y 80%, respectivamente, para el diagnóstico de tuberculosis pulmonar activo. (33)

La prueba de GeneXpert MTB/RIF basada en la amplificación de ácidos nucleicos y la detección de la región especifica del MTB en el gen del rpoB basada en al reacción en cadena de la polimerasa. La prueba también descubre mutaciones asociadas con resistencia a la rifampicina que sirve como prueba diagnóstica de la tuberculosis multidroga resistente. Este sistema totalmente automatizado integra el procesamiento del esputo, extracto de ADN, y amplificación para diagnóstico de tuberculosis, con resultados disponibles dentro de 90 minutos
Ventajas y desventajas del sistema Xpert MTB/RIF test: (34)

Ventajas

• Alta sensibilidad y especificidad
• Prueba de diagnostic y seguimiento
• Resultados en 90 minutos
• Manejo muy sencillo
• 15 minutos de trabajo para el tecnico
• Lectura rápida y clara
• Poca contaminación, no necesita de alto nivel de bio seguridad

Desventajas

• Alto costo
• Necesita electricidad
• Necesita calibración anual
• Requiere varias unidades para un alto volume de trabajo.

Conclusiones.

Más de 9 millones de nuevos casos de tuberculosis de M (MTB) ocurren anualmente a nivel mundial. La tuberculosis (TB) es responsable de 1.7 millones de muertes por año, la inmensa mayoría en países de recursos limitados. Globalmente, la tuberculosis es una causa común de enfermedad y muerte entre los pacientes VIH-infectados.

La microscopía del esputo es la piedra angular de diagnóstico de tuberculosis en los países con limitados recursos, pero sólo tiene una modesta sensibilidad del 35% al 80% para el diagnóstico de la enfermedad, y particularmente baja en los enfermos con VIH avanzada. Aunque el cultivo de MTB es bastante sensible para el diagnóstico de tuberculosis (y permite conocer la susceptibilidad a las drogas), permanece aun inaccesible en los países de bajo recursos. Incluso donde es accesible, los resultados del cultivo no están disponibles hasta 2-6 semanas de tomada la muestra.

El diagnóstico a través del esputo o el cultivo requiere múltiples pasos que impiden significativamente la efectividad del programa. Existe una necesidad urgente para tener un medio diagnóstico exacto, factible, rápido, económico, y de seguimiento para el diagnóstico de tuberculosis, asequible a países de recursos limitados.