CONCLUSIÓN PARA LA TOMA DE MUESTRAS

La muestra debe recogerse en un recipiente estéril (colector), habiendo desinfectado con etanol al 70% el grifo, dejando correr a alta presión un mínimo de 2 litros, sin tocar el borde del grifo, sin respirar ni hablar delante del colector, dejando una cámara de aire para la homogenización de la muestra. Esta debe ser remitida de inmediato al laboratorio o enviada refrigerada (se recomienda gel refrigerante) dentro de las 24 horas.

3- MEDIOS DE CULTIVO RECOMENDADOS

La Farmacopea europea aconseja el medio de cultivo a base de hidrolizado de caseína de soja. La AAMI consigna el medio de cultivo "TSA" (Triptic Soy Agar). Pueden utilizarse también otros medios cuya aptitud para permitir el crecimiento de un amplio espectro de microorganismos haya sido testeada. Debido a que los Microorganismos que habitan en el circuito de agua no poseen nutrientes, el medio empleado para el crecimiento debe ser similar, bajo en nutrientes.

Luego de haber comparado la sensibilidad de diversos medios y de la temperatura de incubación a 37 ó de 20 °C, Ledebo y Nystrand (Artif Organs 1999; 23: 37-43) han recomendado el medio "TGEA" (Tryptone Glucose Extract Agar) el que se incuba por 2 días a 20 °C. (48). Sin embargo el tiempo de cultivo se puede extender hasta 7 días.

Al respecto, en otra publicación (43) los autores expresan lo más significativo de la presente recopilación:

"Este estudio demuestra un incremento de 10 a 100 veces en el recuento bacteriano del fluido de diálisis incubado en Tryptone Glucose Extract Agar (TGEA) a 20 °C durante 5 días comparados con la incubación en Tryptic Soy Agar a 37 °C durante 7 días." (Posteriormente se aplican las recomendaciones de otras asociaciones que han desarrollado estudios similares ampliándose el tiempo a 5 – 7 días).

4- TÉCNICA ANALÍTICA Y RECOMENDACIÓN DEL USO DEL TGEA POR EDTNA /ERCA.

4-1 EDTNA es la European Dialysis & Transplant Nurses Association y ERCA es la European Renal Care Association, – 24 rue Chaucat – F75009, Paris, France.

Los niveles de Hongos y Levaduras (mohos) podrán ser monitoreados periódicamente utilizando otra técnica más específica (agar glucosado de Sabouraud)

4-2 La ERA / EDTA (European Renal Association / European Dialysis and Transplant Association) utiliza y recomienda la técnica para el examen microbiológico de productos no estériles descripta en la Farmacopea Europea (sección 2.6.12), sin embargo no es totalmente apropiada para líquido de diálisis. La evidencia sugiere que un agar bajo en nutrientes es lo más recomendable, como el Agar Triptona Glucosa Extracto (TGEA) o el Reasoner 2A (44 – 45) incubando las muestras durante no menos de 7 días a temperatura ambiente (22 °C). (EDTNA|ERCA JOURNAL 2002 XXVIII 3) Estas condiciones de cultivo brindarán óptimos recuentos para bacterias ambientales (también llamadas Heterótrofas) halladas en agua purificada.

Algunas especies están adaptadas para crecer a mayor temperatura y en un medio más enriquecido, pero la larga incubación permite el crecimiento de la mayoría. Si las normativas locales exigen la detección de Pseudomonas aeruginosa, esto se efectuará en un Agar específico.

El volumen inoculado deberá ajustarse a los límites y a la cantidad de gérmenes que se presume encontrar. Por lo general se utilizan 1 a 5 ml. En el caso que el agua estuviera contaminada, se deberá diluir la muestra con agua estéril para lograr un recuento válido.

Cuando se tratare de agua ultrapura, se filtrarán 100 ml. utilizando una membrana de 0,2 micrones. El filtro será incubado utilizando la técnica convencional. El número de U. F. C. se contará utilizando un medio consistente, cuidadosamente utilizando luz brillante.

La EDTNA – ERCA Guidelines recomienda cultivar en TGEA o en R 2  a 7 días a 20 – 22 °C. La Farmacopea Europea no brinda un límite específico para hongos y levaduras y éstos se agruparán en los Gérmenes Totales Viables.

4-3 PROCEDIMIENTO EN ESPAÑA Y RECOMENDACIÓN DEL T. G. E. A.

En España se sugiere realizar controles bacteriológicos semanales del agua. En los casos en que resulte difícil, se realizarán al menos mensualmente. Un tema fundamental es cómo y cuándo tomar las muestras bacteriológicas y para endotoxinas y cómo procesarlas. Se debe buscar la máxima sensibilidad y para ello, es preciso utilizar volúmenes grandes, con una recogida escrupulosa y un buen transporte, sembrándolos precozmente, en medios de cultivo pobres, a temperatura ambiente y por periodos largos (36).

Metodología óptima (ideal) para el cultivo de bacterias en el agua y líquido para hemodiálisis (Publicación Rafael Pérez-García, Hospital General Universitario Gregorio Marañón, Madrid. España)

Recogida escrupulosa de la muestra: escoger un punto de acceso directo al circuito; desinfectar el punto en donde se tomará la muestra y dejar correr el líquido, desechando los primeros ml. El volumen de al menos 1 ml se recogerá en un recipiente estéril y libre de endotoxinas.

La muestra se mantendrá a 4 º C y se sembrará antes de las 24 h. Se utilizarán volúmenes grandes de la muestra y filtros para la siembra. Siembra en medios de cultivo pobres en nutrientes, como el Reasoner´s 2- agar (R2A) o el Tryptone glucose extract agar (TGEA) – cuya técnica ha puesto a punto y evaluado el autor. Incubar a temperatura ambiente, entre 21 - 24ºC. Lectura tardía, a las 48 - 72 h. y a los 5 - 7 días. Cuantificar número de colonias por ml de muestra y determinar el germen. La AAMI recomienda un sistema más corriente, menos sensible: TSA - agar (soja-triptosa), a 37 ºC y lectura a las 48 h.

4-4 UNA MODIFICACIÓN A TENER EN CUENTA.

El medio CLDE contiene lactosa y azul de bromotimol, un indicador de pH que en medio básico es azul; neutro es verde y ádico es amarillo. En elCLDE, la lactosa es la fuente de Carbono para los microorganismos y su fermentación produce ácido láctico haciendo virar  el indicador al amarillo o a colores intermedios entre el verde y el amarillo. En éste medio, la lactosa está en una concentración de 10 g/L   y el indicador al 0,02 g/L.