Comparación con la performance de equipos comerciales empleados en la evaluación de la Coagulación y la Hemostasia: en los Kit de reactivos empleados para la determinación del tiempo de tromboplastina parcial y del estado del sector intrínseco de la coagulación, los fabricantes han evaluado como performance del método la reproducibilidad del mismo a distintas concentraciones del analito, procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día, y obteniendo para el valor de 45 segundos una DS de 1.1 segundos y un CV de 2.5%; y para el nivel de 62 segundos, una DS de 1.8 segundos y un CV de 3.0%. Esta dispersión de valores resulta menor a la obtenida por nuestro método en la determinación de FP3, pero se debe considerar que la determinación del factor procoagulante de las plaquetas o FP3 es una prueba dinámica, que involucra la inducción de un proceso biológico de generación de FP3.

De todas maneras resulta aceptable, en la validación de un método, toda DS intraensayo menor al 5.00 en la zona de valores fisiológicos, y la DS intraensayo obtenida por nosotros es de 4.17 segundos con un CV del 9.00% en esa zona de la curva dosis respuesta; y toda DS menor al 10 en los controles de rangos fisiológicos interensayo, y nuestro método posee una DS de 3.73 con un CV de 8.30%, para el control interensayo.

Comparación con la performance de distintos equipos comerciales empleados en un control de calidad externo interlaboratorial:

En controles de calidad interlaboratorios efectuados por el Colegio de Bioquímicos de una provincia de la República Argentina en el año 2010, se obtiene en el tratamiento estadístico de los resultados informados por todos los participantes para una muestra mensual tomada al azar, un CV mínimo de 2.92% para la determinación de sodio en suero, con una DS de 4.60; y un CV máximo de 27.17% para la determinación de transaminasa glutámico pirúvica, con una DS de 13.34

Un CV por sobre el 10.00 % se obtuvo para las determinaciones de urea (CV: 11.16%), creatinina (CV:14.55%), uricemia (CV:11.00%), triglicéridos (CV: 12.18%), transaminasa glutámico oxalacética (CV: 24.30%), fosfatasa alcalina (CV:17.46%), amilasa (CV:20.26%), creatinfosfoquinasa (CV: 22.42%), y fosfatemia (CV: 14.45%). De 18 analitos procesados, el 56%, es decir 10 analitos, poseen CV mayor a 10%; contra un 44% con mejor performance.

Recuérdese que el CV interensayo de nuestro método de terminación de FP3, fue de 8.30%, es decir con una buena performance.

Más adelante veremos que la DS y el CV intraensayo es menor a la DS y el CV interensayo. En el primero una misma muestra se procesa diez veces en la misma corrida, es decir, en similares condiciones del ensayo; en el segundo se procesan 10 alícuotas de una misma muestra en distintas corridas, como ocurre en los controles de calidad externos, aunque en este caso concurre también la diferencia de metodología y de aparatología; aunque tiene el beneficio estadístico del gran número de muestras.

En general se admite que DS arroje valores menores a 5.00 en la zona de concentraciones fisiológicas, y de 10.00 en las zonas de concentraciones 3 ó 4 veces superior, intraensayo, lo cual cumple nuestro método de determinación de factor plaquetario 3, cuya DS es de 4.17; o DS menores de 10.00 y de 30.00, respectivamente, en la evaluación del comportamiento interensayo, lo cual también cumplimenta nuestro método con un CV de 8.30%

El cumplimiento de tales parámetros validarían el ensayo.

Validación de la técnica:

1-Especificidad: Se define como la capacidad de un método analítico para medir exacta y específicamente el analito sin interferencias de impurezas, productos de degradación 11, o especímenes químicos o biológicos de reactividad química o de biorreactividad parecida. Se expresa como el grado de inexactitud del método 12. Rampazoo recomienda el análisis de muestras del analito sometidas a condiciones de degradación artificial hasta el 20% de degradación, lo cual constituye un criterio de especial interés cuando se desconocen los productos de degradación. 13

Nosotros hemos comprobado, procesando en la misma corrida el mismo espécimen de PRP con y sin agregado del 10% de caolín, que éste, en el término de 5 minutos, induce la liberación de una cantidad tal de FP3 y de antecedente tromboplastínico plasmático que acelera la recalcificación del plasma a más del doble su velocidad, de tal manera que se obtienen tiempo de alrededor de 45 segundos, contra 105 del PRP sin caolín. Un tiempo intermedio de 71.74 segundos se obtiene incubando el PRP con caolín durante 3 minutos, y 48.15 segundos cuando se lo incuba 5 minutos, demostrándose de este modo la generación de FP3 y de antecedente tromboplastínico plasmático, descriptas por otros autores, durante la incubación del PRP con caolín.

También hemos observado que la agitación excesiva en vortex del PRP luego del agregado del caolín incrementa la cantidad de FP3 liberado, de tal manera que se sugiere una agitación muy suave para mezclar PRP y caolín, de modo de independizar las pruebas de esa variable. La agitación excesiva del PRP sin caolín durante 30 segundos, por su parte, no acelera el tiempo de recalcificación, por lo que se tendría que reconsiderar el grado del efecto mecánico como causa de liberación de FP3 plaquetario.

A distintas alícuotas de la muestra de PRP sin caolín se le añade 5, 10, 15, 20, 25, 30 µl de FP3 exógeno o su sustituto cefalina-caolín y se evalúa los tiempos obtenidos al recalcificarlos. En el tubo donde se obtenga un tiempo semejante al obtenido para los FP3 de plasma normal, se asumirá que el FP3 exógeno añadido es del orden del 27.5%, que es el promedio entre el 25 y el 30% de FP3 liberado en la inducción con caolín, considerado como niveles fisiológicos por otros autores. Con 1:4 del volumen de FP3 exógeno añadido a ese tubo, es decir con un 25% de impurezas o interferentes, se estudiará el sistema PRP+caolín+5 minutos+ 1:4 de FP3, y se definirá la especificidad del método en términos de inexactitud. Si ese 25% de FP3 exógeno fuera previamente sometido a degradación, y al ser añadido al sistema el método no lo detecta o lo hace mínimamente, estaríamos ante la presencia de un método bastante o muy específico. Si ese 25% de FP3 exógeno se añade al sistema sin degradar y el método lo detecta con una respuesta lineal respecto a la curva obtenida con FP3 endógeno, estaríamos ante la presencia de un método específico para FP3. Nosotros elegimos esta segunda opción ya que en la misma sabemos lo que agregamos al sistema y lo que medimos.

Resultados:

Una mezcla de PRP de cuatro pacientes aparentemente normales se procesó a las 2 horas, aproximadamente, de la extracción sanguínea,

preparando 10 tubos plásticos con alícuotas de 300 µl de PRP, a las que se añadió 5, 10, 15, 20, 25 y 30 microlitros de FP3 exógeno o su equivalente en cefalina-caolín. Se obtuvieron los siguientes resultados, respectivamente: 73.82; 58.33; 50.42; 45.15; 35.92; 30.65 segundos.

La muestra correspondiente al agregado de 20 µl de FP3 exógeno, que coaguló a los 45.15 segundos, se correspondió con el FP3 plaquetario inducido por el caolín en PRP normales, con una media de 45.36; el valor de 30.65 segundos correspondiente a 30µl de FP3 exógeno (20 µl + 50%), se podría tomar experimentalmente como un estándar correspondiente a 50% veces más de la media, es decir un St 150%, y el resultado que arrojó en la corrida fue de 30.65 segundos.

El 25% de los 20 µl, es decir 5 µl, será tomado como impureza a los fines de evaluar la especificidad del método en términos de inexactitud, en el sistema integrado por 0.3 ml de PRP+5 µl de FP3 exógeno + 30µl de caolín.