Se añadió 5 µl de FP3 exógeno sin degradar a una serie de tubos conteniendo cada uno 300 µl de PRP correspondientes a un paciente aparentemente normal + 30µl de caolín. Se procesaron en el autoanalizador obteniéndose los siguientes resultados: 51.30, 49.30, 42.20, 35.80, 28.50; con una media de 42.78, una DS de 8.09 y un CV de 18.9%, casi el doble de dispersión del método original. La media bajó, con el añadido del interferente, de un valor de 45.36 a otro de 42.78, es decir 2.58 segundos, correspondientes a un error agregado de 5.69%. La DS del método con el interferente es de 8.09, que resulta menor al límite máximo permitido de 10.00 para concentraciones altas del analito en corridas intraensayos, menor también a 3 DS (4.17 x 3 = 12.51) del ensayo sin el interferente.

Trazada la curva dosis- respuesta correspondiente, graficando en el eje de las abscisas las concentraciones (en % del normal) 12.5, 25, 33.33, 50, 100, 125 y 150%, y los tiempos en que se produjo la coagulación en el eje de las ordenadas, se obtiene una función perfectamente lineal desde la concentración correspondiente al 50% del normal hasta la concentración correspondiente al 150% del normal, por lo que queda demostrado que el método detecta específicamente FP3.

2- Linealidad: Es la capacidad del método analítico para obtener resultados directamente proporcionales a la concentración del analito en un rango determinado. Se determina procesando diluciones progresivas de la muestra ya lista para dosar, y controles de concentración inferior y superior a lo normal si los hubiese, en un rango entre 50 y150% del normal.

Diluciones ya listas para dosar significa diluciones efectuada a los cinco de incubación del PRP con caolín, con solución fisiológica.

No disponemos de controles correspondientes a los valores superiores al 100% con niveles establecidos, de tal manera que nos limitaremos a estudiar la curva para valores inferiores al 100%, aunque se podría usar el agregado de 30 µl de FP3 exógeno como standard 150%, según hemos visto anteriormente.

Es de esperar una relación dosis-respuesta no lineal, a juzgar por el comportamiento de la curva dosis-respuesta en la determinación del porcentaje de actividad del tiempo de protrombina, que también es un método coagulométrico.

Se efectuarán diluciones 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 y 1:32 de PRP en solución fisiológica. El estudio de la linealidad se realiza durante 3 días. La curva de regresión se determina sobre los puntos individuales, graficándose en el eje de las abscisas las diluciones sucesivas y en el eje de las ordenadas la respuesta analítica, es decir, los tiempos obtenidos.

Dentro de la linealidad nos interesa conocer el coeficiente de regresión que viene dado por la pendiente de la gráfica. Este indica la sensibilidad del método y se expresa en unidades de respuesta sobre unidades de dosis. La sensibilidad analítica, es decir, la mínima dosis del analito capaz de detectar el método, es inversamente proporcional a la capacidad del método de detectar pequeñas diferencias en la dosis del analito, y se obtiene dividiendo la pendiente de la curva de calibración por la desviación estándar de las respuestas en cada punto o concentración. Se considera que a mayor pendiente mayor sensibilidad, es decir, que pequeñas variaciones de dosis en abscisas dará grandes variaciones de respuesta del instrumento en ordenadas. Mientras más pequeño sea el coeficiente de variación de la pendiente mayor será la linealidad, de tal modo que valores mayores al 5 % indican falta de linealidad.

Referimos los valores obtenidos para las cuatro primeras diluciones solamente, pues para diluciones mayores a 1:16 y, fundamentalmente, a 1:32, se altera la naturaleza y consistencia del coágulo obtenido por lo que se sale de las condiciones pre establecidas del método y se modifica el indicador del punto final de la reacción produciendo valores erráticos; y son, por otra parte, diluciones muy por debajo del 50% del valor fisiológico, límite inferior recomendado por otros autores.

La performance de un método en que la reacción no es lineal consta, generalmente, de la evaluación de: a) reproducibilidad b) límite de detección.

La reproducibilidad se evalúa calculando la precisión del método a distintas concentraciones, determinando la DS y el CV intraensayo y total. El límite de detección, por su parte, es la mínima cantidad de analito capaz de ser detectada como una muestra distinta de cero, y vendría representada por la ordenada al origen, o por la media de una serie de medidas del blanco de reactivos del método, más o menos 3 DS.

La ordenada al origen, es decir el valor de la respuesta para la dosis cero de FP3 endógeno y/o exógeno, corresponde a los valores del tiempo de recalcificación del plasma o tiempo de Howell en PRP, que cuando se efectuaba a las dos horas de la extracción sanguínea arrojaba una media de 190 segundos con una DS de 30 segundos, y un valor de referencia de 100 a 280 segundos.

La DS de la ordenada al origen sería 30 segundos y la sensibilidad del método en esa zona de muy baja concentración sería de 190/30, es decir de 6.30 segundos.

La mínima concentración capaz de detectar el método es la inversa de la sensibilidad, es decir 0.16, lo que representa el 16% del normal.

Resultados:

Corrida 1 de 3:
Dilución 1:1 ………………….….41.00 segundos
Dilución 1:2 ……………….…… 61.17 segundos
Dilución 1:4 …………………….. 98.31 segundos
Dilución 1:8 …………………….. 144.0 segundos

Corrida 2 de 3:
Dilución 1:1 ……………….…… 48.44 segundos
Dilución 1:2 …………………….. 60.20 segundos
Dilución 1:4 …………………….. 91.77 segundos
Dilución 1:8 ……………………. 128.6 segundos


Corrida 3 de 3:
Dilución 1:1 …………..…… 45.25 segundos
Dilución 1:2 ……………….. 68.10 segundos
Dilución 1:4 ………………. 114.60 segundos
Dilución 1:8 ………………. 257.90 segundos
Dilución 1:16 …………….. 311.90 segundos

Como hemos explicado recientemente diluciones mayores a 1:8 no alcanzan a producir un coágulo firme variando las condiciones de detección del ensayo.

La media para el punto 1:1 es de 44.90, la DS es de 3.73, el coeficiente de regresión es de 44.49, y la sensibilidad del método en esa zona es de 12.04; la media para el punto 1:2 es de 63.16 la DS 4.31, el coeficiente de regresión es de 31.58 y la sensibilidad es de 7.33; la media para el punto 1:3 es de 79.06, con una DS de 2.25, un coeficiente de regresión de 26.25 y la sensibilidad de 11.67; la media de la dilución 1:4 es de 101.56, la DS es de 11.76, el coeficiente de regresión es de 25.39 y la sensibilidad del método de 2.16; la media para el punto 1:8 es de 176.83, la DS 70.63, el coeficiente de regresión es de 22.10 y la sensibilidad de 0.31; es decir, el método es mucho más preciso (menor DS) y más sensible en las diluciones menores, hasta 1:3, que en diluciones mayores; siendo muy impreciso y poco sensible en el punto 1:8