Vesalio permaneció en Lovaina poco tiempo, a causa también de una disputa con su maestro.

Se instaló durante un tiempo en Venecia, y en 1536 se trasladó a la Universidad de Padua (Universitas artistarum), y se doctoró en Padua el 5 de diciembre de 1537 y posteriormente, con solo 24 años lo nombraron ´explicator chirurgiae´ de Cirugía, que comprendía la enseñanza teórico-práctica de la cirugía. Dio también lecciones en las universidades de Bolonia y de Pisa. 

Su método de enseñanza fue revolucionario. Tradicionalmente el profesor de anatomía enseñaba leyendo los textos clásicos (usualmente los de Galeno) y su exposición era seguida de la disección de un animal, realizada por un prosector, bajo la dirección del profesor.

Vesalio, en cambio, convirtió la disección en la parte más importante de la clase, llevándola a cabo por sí mismo, rodeado por sus alumnos. Para Vesalio, la observación directa era la única fuente fiable, lo que suponía una importante ruptura con la práctica medieval, basada fundamentalmente en los textos de Mondino de Liuzzi y de Galeno.

Recopiló sus dibujos de anatomía, para uso de sus estudiantes, en las célebres ´Tabulae anatomicae Sex’ (1538) al saber que sus estudiantes los estaban copiando. En 1539 publicó también una versión actualizada del vademécum anatómico de Galeno, ‘Institutiones Anatomicae’. Cuando esta obra llegó a París uno de sus antiguos profesores publicó un ataque contra ella.

En 1539 un juez de Padua, interesado por los trabajos de Vesalio, hizo que se le facilitasen los cadáveres de los criminales ejecutados para la disección. Esto le permitió mejorar sus diagramas anatómicos. En 1541, mientras estaba en Bolonia, Vesalio descubrió que las investigaciones de Galeno estaban basadas en la disección de animales, y no de seres humanos. Como la disección humana había estado prohibida en la antigua Roma, Galeno había disecado en su lugar monos de Berbería, creyendo que sería anatómicamente similar al ser humano.

Vesalio, apoyándose en sus propias observaciones, publicó una corrección de las ‘Opera omnia’ de Galeno, y comenzó a escribir su propio texto de anatomía. Continuó provocando controversias, esta vez no demostrando los errores de Galeno, sino de Mondino de Liuzzi, e incluso de Aristóteles: los tres habían hecho suposiciones acerca de las funciones y estructura del corazón que eran claramente erróneas. Vesalio descubrió que el corazón tenía cuatro cavidades, que el hígado tenía dos lóbulos y que los vasos sanguíneos comenzaban en el corazón, y no en el hígado.

Al final dichos dibujos se convertirían en su obra maestra ´De humani corporis fabrica´, en siete volúmenes, cuyo verdadero titulo era ‘Andreae Vesalii Bruxellensis, scholae medicorum Patauinae professoris, de Humani corporis fabrica Libri Septem’ publicado en 1543 en Basilea.